c-Jun氨基末端蛋白激酶在人角膜上皮细胞调控NLRP3炎症小体激活中的作用

谭秋凡，陈淮程，朱奕睿，朱韩磊，郑钦象，陈蔚

（1.温州医科大学附属眼视光医院 角膜病专科，浙江 温州 325027；2.义乌市妇幼保健院 五官科，浙江 金华 322000）

最近一项Meta分析[1]显示：有17%的国民患有干眼，其中40岁以上女性高达21.6%，显著高于男性（占12.5%）[2]。而超过60岁的人群中有34.4%患有干眼。近年来，干眼的患病率逐年上升，并且发病趋于年轻化[3]，严重影响生活质量、学习工作效率。泪液高渗透性和炎症反应被认为是干眼发病的关键机制之一。前期的研究证实NLRP3炎症小体在干眼发病进程中发挥启动炎症的作用[4-5]，但活性氧（reactive oxygen species，ROX）如何激活NLRP3炎症小体，如何调控NLRP3的活化及表达目前仍无定论。c-Jun氨基末端蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）在一系列外界刺激下，如渗透压、热休克、紫外线照射等会发生磷酸化反应，调节细胞增殖、再生、凋亡等过程[6]。本研究以人角膜上皮细胞（human corneal epithelial cells，HCECs）株为研究对象，通过JNK抑制剂SP600125抑制JNK的活性，进一步探讨JNK在HCECs调控NLRP3炎症小体激活中的作用，从而为干眼治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 细胞株及主要材料 人12-SV40角膜上皮细胞株（CRL-11135，HCECs）购买于美国ATCC公司；JNK抑制剂SP600125购自美国Sigma公司；兔抗人JNK抗体、兔抗人p-JNK抗体、兔抗人NLRP3抗体、兔抗人caspase-1抗体、兔抗人IL-1β抗体购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）购自合肥Biosharp公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁公司；DMEM/F12培养基、0.25%含EDTA胰酶、人表皮生长因子购自美国Gibco公司；引物购自美国Invitrogen公司；RNA提取试剂盒购自美国ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，同时加入胰岛素和人表皮生长因子，使胰岛素在培养基里的终浓度为5 μg/mL，人表皮生长因子的终浓度为10 ng/mL。并将其置于温度为37 ℃、含5% CO2、湿度为90%的细胞培养箱内常规传代培养。待细胞生长至70%～90%的融合状态用于实验。

1.2.2 溶液的配制：①高渗液（500 mOsm）的配制：向无血清的DMEM/F12培养基中加90 mmol/L NaCl溶液配制而成。②SP600125配置：将10 mg的SP600125干粉剂溶于1 mL的37 ℃ DMSO溶液中，配制成104 μg/mL的母液，-20 ℃冰箱保存备用；用不含血清的培养基稀释母液，配制成终浓度为20 μmol/L的JNK抑制剂用于实验。

1.2.3 实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测JNK、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β等的mRNA：取接种于12孔板的HCECs，弃旧培养基，给含500 mOsm高渗液的高渗培养基和正常等渗培养基，继续培养4 h后，收集细胞备用。相同实验重复3次。按RNA提取试剂盒说明书提取细胞的RNA，并根据所测浓度计算出合成cDNA模板所需的总RNA量。利用M-MLV反转录试剂盒合成cDNA，将反转录得到的cDNA -20 ℃保存，后续进行PCR的扩增。基因引物序列如下：JNK1正向引物5’-TGCAGCATGGCAGCTATTATC-3’，反向引物5’-AGCATCAATACTCGACATGAACG-3’；JNK2正向引物5’-TGAAACTAAGCCGTCCTTTTCAGA-3’，反向引物5’-TTCCAG CTCCATGTGAATAACCT-3’；NLRP3正向引物5’-CGTGAGTC CCATTAAGATGGAGT-3’，反向引物5’-CCCGACAGTGGATAT AGAACAGA-3’；caspase-1正向引物5’-TTTCCGCAAGGTT CGATTTTCA-3’，反向引物5’-GGCATCTGCGCTCTACCATC-3’；ASC正向引物5’-TGGATGCTCTGTACGGGAAG-3’，反向引物5’-CCAGGCTGGTGTGAAACTGAA-3’；IL-1β正向引物5’-AGCTACGAATCTCCGACCAC-3’，反向引物5’-CGTTATCC CATGTGTCGAAGAA-3’；β-actin正向引物5’-GACATCCG CAAAGACCTG-3’，反向引物5’-GGAAGGTGGACAGCGAG-3’。RT-PCR检测采用SYBR Green荧光染料法。计算出目的基因mRNA相对定量的表达量。每组均设3个重复孔，最终结果取3次的平均值。

1.2.4 caspase-1活性试剂盒测定caspase-1活性：取接种于6孔板的的HCECs，加入20 μmol/L JNK抑制剂SP600125预处理2 h后，给予500 mOsm的高渗液刺激，继续培养6 h后，收集细胞备用。另设等渗组和高渗组，相同实验重复3次。根据caspase-1活性检测试剂盒说明书进行操作。

1.2.5 AOEB染色（吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色）检测细胞凋亡情况：取接种于12孔板的HCECs，弃旧培养基，加入20 μmol/L JNK抑制剂预处理2h后，给予500 mOsm的高渗液刺激，继续培养12 h后，按照说明书进行染色后拍片。

1.2.6 免疫荧光染色法检测NLRP3和IL-1β蛋白表达情况：细胞消化爬片，加入20 μmol/L SP600125预处理2 h后，给予500 mOsm的高渗液刺激，继续培养6 h后，细胞爬片用PBS洗3遍，用4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3遍，再用0.5% Triton-100打孔10 min，PBS洗3遍，然后用20%山羊血清37 ℃下封闭2 h，更换培养基，加NLRP3或IL-1β兔抗（1∶200）4 ℃过夜。PBS洗3遍，用荧光标记的二抗在37 ℃下避光孵育1 h。再用PBS洗3次，DAPI（1∶1 000用抗淬灭剂稀释）染核，封片，置于室温下晾干20 min后拍片。

1.2.7 Western blot检测JNK、p-JNK、NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表达：取接种于6孔板的HCECs，弃旧培养基，加入20 μmol/L JNK抑制剂SP600125预处理2 h后，给予500 mOsm的高渗液刺激，继续培养2 h后，收集细胞备用，来进行JNK、p-JNK蛋白水平检测，培养6 h后，相同方法进行余下相关蛋白检测。另外再设置等渗组和高渗组。相同实验重复3次。Bradford法测定样品总蛋白浓度，每组各取50 μg总蛋白样品，以8%、10%或12%的分离胶SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白。将分离的蛋白转移至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBS封闭2 h。将膜分别泡入兔抗JNK抗体（1∶1 000）、兔抗p-JNK抗体（1∶1 000）、兔抗NLRP3抗体（1∶1 000）、兔抗cas-pase-1抗体（1∶10 000）、兔抗ASC抗体（1∶10 000）和兔抗GAPDH抗体（1∶5 000）中，4 ℃孵育过夜；TBST洗膜后加山羊抗兔HRP标记的二抗（1∶3 000稀释），常温孵育1 h，TBST洗膜次。用ECL发光液标记然后分析。

1.3 统计学处理方法 采用GraphPad Prism 6软件进行数据图表绘制和统计学分析。计量资料以 ±s表示，采用单因素方差分析进行多组比较，两两比较采用Tukey法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 应用JNK抑制剂抑制JNK可下调炎症小体和炎症因子mRNA的表达 经过20 μmol/L JNK抑制剂SP600125预处理的HCECs，细胞内的JNK表达被抑制，通过检测炎症小体和炎症因子的表达，说明JNK在本细胞高渗模型中所起的作用。RT-PCR检测结果显示，与等渗组相比，高渗组HCECs内JNK1、JNK2、NLRP3、caspase-1、ASC和IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-6的mRNA表达量均显著上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。与高渗组比，高渗+JNK抑制剂组HCECs内JNK1、JNK2、NLRP3、caspase-1和IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-6 mRNA表达量显著下降，差异均有统计学意义（P＜0.05），而ASC差异无统计学意义（P=0.431）。见图1。

2.2 JNK抑制剂抑制高渗透压对HCECs中caspsase-1活性的影响 caspase-1活性测定结果显示，与等渗组比，高渗组HCECs内caspase-1活性明显上升，差异有统计学意义（P=0.020）。而与高渗组比，高渗+JNK抑制剂组中caspase-1活性下降，差异有统计学意义（P＜0.001），说明JNK抑制剂SP600125也能够抑制高渗透压对caspase-1的激活。见图2。

图1 3组HCECs中JNK1、JNK2、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-6的mRNA相对表达量

图2 3组HCECs中caspase-1活性的变化

2.3 JNK抑制剂缓解高渗透压引起的HCECs细胞凋亡 用AOEB染色检测高渗刺激以及是否有SP600125预处理的细胞凋亡情况，结果表明，在500 mOsm高渗刺激12 h后，细胞内的红色荧光显著增强，说明高渗可以引起HCECs的凋亡。SP600125预处理后，红色的荧光明显减弱，提示JNK抑制剂能够缓解高渗引起的细胞凋亡。见图3。

图3 3组HCECs凋亡情况（AOEB染色，×10）

2.4 JNK抑制剂抑制高渗引起的HCECs中NLRP3和IL-1β蛋白的过表达 如图4所示，蓝色荧光为视野下所有由DAPI染色的细胞核，绿色荧光为被染色的NLRP3和IL-1β蛋白。高渗刺激6 h后NLRP3和IL-1β的蛋白表达水平明显上升。SP600125预处理后，NLRP3和IL-1β的蛋白表水平明显降低。结果提示JNK抑制剂通过抑制JNK下调NLRP3和炎症因子IL-1β的表达。

图4 3组HCECs中NLRP3和IL-1β蛋白表达（免疫荧光，×40）

2.5 JNK抑制剂抑制高渗引起的HCECs中p-JNK、NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白的过表达 与等渗组比，高渗组在500 mOsm高渗刺激2 h后HCECs JNK表达量无明显变化（P=0.795），p-JNK表达量显著上升（P=0.024），刺激6 h后，NLRP3、caspase-1和IL-1β的蛋白表达量显著上升（P＜0.01）。而与高渗组比，高渗+JNK抑制剂组JNK表达量无明显变化，p-JNK、NLRP3、caspase-1和IL-1β的蛋白表达量显著下降（P＜0.05），ASC则无明显变化（P＞0.05）。见图5。结果进一步提示JNK抑制剂通过抑制JNK下调NLRP3炎症小体的表达，从而降低炎症因子IL-1β的表达，且JNK对后续因子的调控是通过JNK磷酸化进行的。

3 讨论

本研究利用高渗刺激HCECs的干眼体外细胞模型，进一步研究ROS-NLRP3-IL-1β这一信号通路。通过JNK抑制剂来探究JNK在这一通路中的作用，提示JNK通过其磷酸化作用连接ROS和NLRP3-IL-1β通路。

图5 3组HCECs中p-JNK、NLRP3、caspase-1、ASC、IL-1β蛋白表达量

目前已有大量研究证实，高渗透压刺激能诱发各种组织细胞，包括肾细胞、心肌细胞、肝细胞、角膜上皮细胞等ROS的生成骤增，随后启动细胞的多条信号通路，从而诱导炎症反应和细胞凋亡[7-9]。COPP等[10]在前人的基础上研究发现，猴肾细胞在高渗刺激后，立即出现线粒体膜电位消失，不过这些现象具有可逆性，在高渗1 h后如果更换等渗培养液，分解的线粒体会在1 h内重新聚合并且完全恢复膜电位。说明高渗刺激是一种线粒体高度敏感的刺激信号，线粒体结构和功能随高渗刺激的强度和时间做出不同的反应和相应的调整。本研究显示HCECs的NLRP3和IL-1β的激活需在高渗刺激达到一定的渗透压阈值才会出现，说明HCECs具有较强的抗氧化系统和渗透压平衡系统，能够抵御轻中程度的渗透压升高。采用500 mOsm高渗透压是依据本课题组之前的研究结果和相关文献的报道而定[5，11]。我们曾做过小鼠干眼动物模型的体内实验，证明用渗透压保护剂左旋肉碱点眼能减轻干眼眼表炎症反应和细胞凋亡[9]。有研究表明泪膜高渗是干眼发病的重要核心机制之一，它与眼表免疫炎症反应和病理性细胞凋亡形成恶性循环，导致角膜屏障功能受损，共同促进干眼的发生和发展，为干眼病最主要的病理生理改变[12]。在本研究中，500 mOsm高渗诱导的干眼细胞模型中HCECs内JNK、NLRP3和炎症因子IL-1β表达升高。说明JNK等表达于HCECs，且在渗透压为500 mOsm时升高明显。

近年来很多基础研究发现JNK与多种疾病炎症反应有关。叶黄素抑制高渗诱导的HCECs IL-6的分泌，这是由于p38、JNK和NF-κB通路失活而发生[13]。在LPS/D-Gal所致的肝炎中AMPK可能是一个有害因素，它通过增强JNK活性所致的凋亡起作用[14]。慢性HIV-1感染中，miR-126-5p会通过p-JNK表达增强而增强LPS诱导的单核细胞炎症反应[15]。五味子木脂素提取物通过调控NF-κB、JNK和Bcl-2/Bax通路，联合抗氧化、抗炎、抗凋亡来减轻炎症反应和细胞凋亡来防止CCl-4引起的肝损伤[16]。这些研究都说明JNK与炎症反应的密切关系。我们发现在HCECs，通过特异性的JNK抑制剂SP600125来抑制高渗诱导的HCECs中JNK活性，检测到炎症因子IL-1β等的表达下降。该结果提示高渗诱导的HCECs炎症因子IL-1β表达升高可能与JNK的活性相关。这与JNK在其他系统所致的炎症反应一致。

诸多基础研究发现，NLRP3与线粒体、ROS也存在着密切的联系。细胞自体吞噬能力是保持线粒体结构和功能稳定的关键因素，通过对线粒体的影响来调控ROS的生成和NLRP3的激活[17-18]。ZHOU等[18]的研究结果也显示，人巨噬细胞自吞噬功能被抑制后，线粒体受损且ROS不断产生，继而激活NLRP3炎症小体。虽然目前已有大量的证据显示NLRP3的激活与线粒体ROS的过度生成有直接相关性，但线粒体ROS介导NLRP3激活及炎症小体形成的具体机制仍不明确。有研究阐述兔角膜上皮细胞ROS升高导致JNK炎症反应信号通路和调控CD95/CD95L介导的细胞凋亡[19]。迄今为止，JNK与NLRP3炎症小体之间的关系仍不是十分清楚。我们通过JNK抑制剂来抑制高渗诱导的HCECs中JNK的活性，检测到炎症小体聚合成分NLRP3、caspase-1以及炎症因子IL-1β的mRNA表达下降，而ASC的表达与是否使用JNK抑制剂没有明显关系，Western blot结果中ASC的蛋白表达变化也未出现相关变化，NLRP3、caspase-1以及炎症因子IL-1β蛋白变化与mRNA变化一致，提示高渗诱导的HCECs中NLRP3炎症小体和炎症因子IL-1β表达的升高与JNK相关，免疫荧光的结果也与之相符。而JNK对IL-1β的调控是通过NLRP3、caspase-1进行的，与其聚合成分ASC没有明显关系。本研究发现，3组p-JNK蛋白发生了明显变化，而JNK蛋白本身基本无变化，这说明JNK是通过其磷酸化而作用的。

利用JNK抑制剂可以有效降低NLRP3炎症小体和炎症介质IL-1β等的分泌，这提示JNK抑制剂很可能成为针对IL-1β相关炎症疾病的治疗药物。由于JNK不仅在激活炎症因子的通路上起到重要的作用，它也能通过caspase-1的活化而导致细胞死亡，故直接抑制JNK的活性，其效果会优于目前已用于临床的IL-1β抑制剂，这对炎症性疾病的治疗意义重大。由于渗透压升高会通过JNK介导的途径导致角化蛋白产生增多和细胞活性减少，抑制JNK产生会下调由于高渗所致的人原代角膜上皮细胞的角化作用，这对预防角膜上皮角化干眼症有潜在治疗意义[20]。另外抑制p38/MAPK途径可能是辐射所致泪腺损伤的有效治疗措施[21]。这些都说明以JNK为靶点治疗角膜疾病具有重大意义。

综上所述，高渗刺激引起HCECs中JNK磷酸化增强和炎症小体聚合成分NLRP3、cas-pase-1和炎症因子IL-1β的表达均明显增高，抑制JNK活性可以下调它们的表达，提示JNK对NLRP3介导的炎症反应具有调控作用。高渗引起HCECs JNK磷酸化增强后，它通过什么途径影响NLRP3炎症小体表达的变化、炎症因子表达和细胞凋亡还有待深入研究，但NLRP3激活与JNK的相关性已经确定，也为后续临床相关的研究做了必要的方向性指示。