CSFV的反向遗传系统

赵妍

（武汉大学生命科学学院，武汉 430072）

1 引言

反向遗传学是利用病毒的全长基因组来产生完整病毒的方法，是现在病毒学研究中最强有力的工具。反向遗传学通常用于研究病毒复制、感染、蛋白功能、病毒与宿主的相互作用、抗病毒及疫苗研究[1]。近年来，反向遗传学在CSFV的研究方面得到不断发展，本文就CSFV的几种反向遗传系统进行系统阐述，以期为CSFV的研究及防控提供参考。据统计，我国每年因猪瘟造成的经济损失已超过100亿元。猪瘟严重阻碍养殖业的健康发展，并对食品安全造成威胁。因此，对该病进行全面、综合防控，具有必要的现实意义。本文对CSFV及功能相关基因、蛋白的研究进展进行介绍，为全面了解CSFV、全方位防控猪瘟提供理论支持。

2 CSFV的几种反向遗传系统

2.1 T7 RNA聚合酶介导的体外转录反向遗传学系统

T7 RNA聚合酶，是一种高度特异识别T7启动子序列的DNA依赖的5'→3'RNA聚合酶。T7 RNA Polymerase可以催化单链或双链DNA T7启动子下游NTP的掺入，合成与T7启动子下游的模板DNA互补的RNA[2]。

Meyers（Meyers et al.,1996）首先对 CSFV 5’到 3’进行了全基因组鉴定，将CSFV全基因组克隆到低拷贝质粒中，并在基因组3’端加入T7启动子，利用Srf I将质粒线性化后，在T7 RNA聚合酶作用下体外转录得到RNA，并转染进SK6细胞系中拯救病毒，这一方法在现在的CSFV研究中依然应用十分广泛。Fan（Fan et al.,2009）将上述方法进行了改进，将由T7 RNA聚合酶体外转录产生的vRNA转染到BHK21细胞系中，培养一段时间后，将含有病毒的上清感染PK15细胞，用此方法得到的CSFV病毒滴度是之前的8倍左右。

2.2 T7 RNA聚合酶介导的体内转录反向遗传学系统

Gennip（Gennip et al.,1999）建立了一种更方便、高效的体内转录反向遗传系统。首先他建立了可以稳定表达T7 RNA聚合酶的SK6细胞系SK6-T7 RNA pol，将线性化的CSFV cDNA转染该细胞系，转录过程在细胞中完成并得到病毒RNA，产生CSFV病毒，该方法大大提高了病毒滴度，其滴度约为体外转录的 200 倍[3]。Bergeron（Bergeron,2002）通过在 CSFV 3’端插入了HDV核酶及T7终止子，构建了一种新型的基于T7 RNA聚合酶的体内转录反向遗传学系统，该系统不需要Srf I就能在CSFV末端形成精确的3’NCR，节约了构建成本。

2.3 II型RNA聚合酶介导的反向遗传学系统

Li（Li et al.,2013）在CSFV 5’NCR加入 CMV启动子、T7启动子和HamRZ，在3’NCR加入HdvRZ，T7终止子和SV40 polyA，HamRZ与HdvRZ可以生成正确的5’NCR及 3’NCR，且能在T7 RNA聚合酶或者II型RNA聚合酶的作用下进行转录，该方法拯救的病毒滴度是体外转录的120倍。

2.4 I型RNA聚合酶介导的反向遗传学系统

本实验室在上述基础上，构建了一种新的依赖polⅠ拯救病毒的CSFV cDNA克隆，我们在PK15细胞基因组中扩增得到猪的启动子，并参照文献合成在哺乳动物细胞中具有极高终止效率的鼠终止子，分别插入CSFV 5’NCR之前和3’NCR之后。该系统能直接将质粒转染到细胞中，拯救出CSFV病毒，这种基于polⅠ启动子的反向遗传操作系统能产生具有精确末端基因组的CSFV，且具有更高的拯救效率，为后续修饰性减毒活疫苗和标记疫苗的研发奠定了坚实的基础。

3 带有标记的CSFV反向遗传系统

基于传统的反向遗传系统，具有标记或定量功能的CSFV cDNA克隆被设计出来，如在Li实验组建立了一种简化的中和抗体试验，用于检测CSFV，首先在Npro后插入了EGFP基因，在病毒产生的同时合成EGFP，从而省去荧光染色，达到检测病毒的目的[4]。本实验室在1.4中的反向遗传系统的基础上，在Npro后面加入了Rluc基因，得到了可以用于定量实验的CSFV反向遗传系统，即可以通过收集Rluc氧化过程中释放的生物荧光，定量地检测转录因子与目的基因的相互作用。

带有标记的CSFV反向遗传系统在传统的反向遗传系统的基础上，进一步简化了实验步骤，在达到实验目的的同时，使反应更加快速，简便，增加了方法的实用性，为后续开展修饰性减毒活疫苗和标记疫苗的研发做了很好的铺垫。

4 展望

反向遗传操作系统为RNA病毒研究提供了一个强有力的平台，能够恢复具有全长病毒基因组的病毒[5]。利用这个平台，人们可以通过基因重组、基因突变等 手段来研究病毒的复制、感染，病毒蛋白的功能、病毒与宿主细胞之间的关系。抗病毒策略和标记疫苗的发展也离不开反向遗传操作，如找出与毒力相关性基因，对其进行缺失或修饰处理，从而得到新的无毒或减毒毒株，以此制备新型的减毒活疫苗，同时可以制备嵌合抗体，开发多价疫苗[6]。反向遗传系统作为动物病毒的研究方法，已广泛应用于动物疫苗、CSFV毒力机制及蛋白功能研究中，极大地推动了动物病毒的研究发展，为疾病的研究及防控起着重要作用。