癌胚抗原与基质蛋白22双标记时间分辨荧光检测试剂盒的研制及效能评价

梁焕坤，叶景文，李佳丽，陈翠翠，郭晓晓，刘细潘，钟树海，黎杰星，李来庆

广州优迪生物科技股份有限公司，广东 广州 510663

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第1位，而在西方其发病率仅次于前列腺癌，居第2位[1-2]。2012年全国肿瘤登记地区膀胱癌的发病率为6.61/10万[3-4]，列恶性肿瘤发病率的第9位。膀胱癌复发率高[5]，复发后的病例常伴有肿瘤病理分级增加、肌层浸润或远处转移。因此，早期做出正确的诊断对疾病的治疗与预后有重要的临床意义。目前临床上面测定癌胚抗原（CEA）和核基质蛋白22（NMP22）的方法，都是采用单标记方法，即1次检测只能得到1种标志物的含量，通量较小。本研究以双抗夹心法，建立同时检测CEA和NMP22的双标记时间分辨免疫荧光分析（TRFIA）法，为膀胱癌快速准确检测提供新的理念和方法。

1 材料与方法

1.1 材料

抗CEA和NMP22单克隆抗体自制；Eu3+标记试剂盒购自PerkinElmer；BSA来源于Fitzgerald；Sephades-G50填料购自GE；96孔板购自Costar；CEA测定试剂盒（酶联免疫法）购自北京热景生物公司；包被缓冲液、洗涤液、封闭液、增强液均为自制。DR-6606时间分辨荧光分析仪购自广州市达瑞生物技术股份有限公司。88份膀胱癌阳性尿液样品和60份膀胱癌阴性血液样品均由济南军区第88医院提供。

1.2 固相包被抗体的制备

用50 mmol/L、pH 9.6的碳酸盐缓冲液将CEABSA和NMP22-BSA的包被原稀释成2 μg/mL，100 μL/孔同时加入到96孔板中，4 ℃过夜，弃包被液，加入封闭液，37 ℃封闭2 h，弃掉封闭液，洗涤，真空抽干冷冻并于–20 ℃保存

1.3 Eu3+和Sm3+标记抗体

将0.5 mg标记抗体加入Millipore的带有滤膜的离心管中，8000 r/min离心8 min。再用标记缓冲液（50 mmol/L，Na2CO3，pH 9.0）重复洗涤6次。将200 μL标记抗体和50 μg铕（或钐）标记试剂充分混匀，25 ℃振荡过夜。

1.4 Eu3+和Sm3+标记抗体的纯化

标记完成后用Sephadex G-50层析柱分离纯化，洗脱液（含0.9% NaCl的50 mmol/L的Tris-HCl）洗脱，同时收集流出液（1 mL/管），逐管测量吸光度（A280），测定蛋白含量，根据Eu3+和Sm3+标记试剂盒说明书所提供的公式测定标记率和蛋白回收率。

1.5 标准品的制备

用含0.2%BSA，0.1%NaN3，50 mmol/L的pH 7.8 Tris-HCl缓冲液，将CEA蛋白稀释成0、1、5、25、50、250、500、600 ng/mL系列参考标准溶液；将NMP22蛋白稀释成0、1、10、50、100、500、1000 U/mL系列参考标准溶液，每瓶1 mL分装，–20 ℃保存备用。检测CEA和NMP22的标准曲线，用双对数数学模型（Log-Logit）拟合。

1.6 分析操作程序

向包被酶联板上加入25 μL CEA/NMP22参考标准品或待测血清，再加入200 μL分析缓冲液，震荡温育1 h，洗涤液洗涤4次，再加入以分析缓冲液1:50～1:100倍稀释的Eu3+-CEA单克隆抗体与Sm3+-NMP22单克隆抗体的混合物200 μL/孔，震荡温育1 h，洗涤液洗涤6次，最后加入增强液200 μL/孔震荡5 min后在时间分辨荧光检测仪上进行检测。

1.7 TRFIA法性能检测

（1）稀释回收率：从收集的88份膀胱癌阳性患者尿液样品中随机抽取3份尿液样本，其CEA的浓度分别为：24、58、73 ng/mL，取另3个患者的尿液，其NMP22的浓度分别为：26、99、133 U/mL，稀释浓度均为1:20、1:40、1:80倍比稀释，每个样本重复3次，重复检测3次，比较样本的测定值、真值及其比值。（2）线性范围：CEA抗原和NMP22作为标准品稀释成不同浓度进行测定，CEA浓度为0、1、5、25、50、250、500、600、800、1600 ng/mL，NMP22浓度为0、1、10、50、100、500、1000、1250、5000 U/mL，每个浓度测定3个复孔，重复测定3次，进行剂量线性回归分析和计算试验的相关系数。（3）灵敏度：以零参考标准品（CEA和NMP22抗原）当做样本，将测定20次的荧光值均值加上2倍的标准差代入标准曲线方程，计算出最低检测量。（4）精密度：将自制的质控品（CEA和NMP22抗原）稀释至高、中、低3个浓度，各设3个复孔重复检测10次，计算各质控品检测值的均数、标准差及变异系数（CV）值。（5）稳定性：自制的试剂盒置于4 ℃冰箱6月和37 ℃ 7 d，对试剂盒的物理外观，剂量-反应曲线的线性、准确度、灵敏度、最低检测量等指标进行测定，具体检测方法同上步骤（1）和（4）。（6）与其他膀胱癌检测方法比较：用自行制备的CEA和NMP22双标记时间分辨荧光检测试剂盒与人CEA ELISA检测试剂盒、病理学同时检测已用膀胱尿道镜检确定的88例膀胱癌尿液样本和60份膀胱癌阴性尿液样本，对检测结果进行分析。

2 结果

2.1 标记物的标记率和回收率

Eu3+和Sm3+标记物的标记率分别为9.53/抗体、9.25/抗体，蛋白回收率为分别89.4%、91.10%。

2.2 双标记CEA/NMP22标准曲线

CEA和NMP22标准曲线和相关系数分别为：CEA：y=0.9847x+4.0943，R2=0.9995； NMP22：y=1.0198x+3.9834，R2=0.9994，表明线性相关性良好，其剂量-反应曲线如图1所示，表明本试剂盒有良好的剂量-反应效应。

2.3 稀释回收率

CEA的回收率在95.89%～100.64%之间；NMP22的回收率在97.74%～103.3%之间。

2.4 线性范围和灵敏度

CEA蛋白当浓度低于600 ng/mL时，荧光值呈线性升高（R2=0.9995，图2A）；浓度高于600 ng/mL时，荧光值不再呈线性升高，曲线呈缓慢上升（图2B），故CEA蛋白标准曲线的线性范围为0～600 ng/mL。NMP22蛋白当浓度低于1000 ng/mL时，荧光值呈线性升高（R2=0.9994, 图2C）；浓度高于1000 ng/mL时，荧光值不再呈线性升高，曲线呈缓慢上升（图2D），故NMP22蛋白标准曲线的线性范围为0～1000 ng/mL。以零参考标准品测定20次的荧光值均值加上2倍的标准差代入标准曲线方程，计算得出试剂盒检测CEA的灵敏度为 0.12 ng/mL，NMP22的检测灵敏度为0.21 U/mL。

2.5 精密度

用自制的CEA/NMP22的TRFIA试剂盒分析，批内CV＜5%，批间CV＜10%（表2）。

图1 双标记CEA/NMP22标准曲线

表1 自制CEA/NMP22 TRFIA试剂盒回收率评价结果

图2 试剂盒线性范围测试结果图

表2 自制CEA/NMP22的TRFIA试剂盒分析

2.6 稳定性

稳定性测试结果表明，自制的试剂盒置于4 ℃冰箱能稳定6月以上，37 ℃热破坏性试验能持续7 d以上。

2.7 与膀胱癌其他诊断方法比较

自行制备的CEA/NMP22 TRFIA检测试剂盒与CEA ELISA检测试剂盒、病理学的检测结果比较见表3～4。TRFIA试剂盒与膀胱尿道镜检方法比较，阳性率符合率为97.7%，阴性符合率为100%。

表3 几种方法检测膀胱癌尿液样本的符合率（n=88）

表4 几种方法检测膀胱癌阴性尿液样本的符合率（n=60）

3 讨论

膀胱肿瘤标记物作为一种新兴的膀胱癌诊断指标，是膀胱癌早期诊断、指导治疗及评估预后的有效手段[7-15]。CEA最初发现于结肠癌及胎儿肠组织中，正常尿路上皮不存在癌胚抗原，但膀胱癌患者的血浆和尿中CEA却明显上升。连续监测膀胱癌患者尿液中CEA水平可用于肿瘤治疗的疗效观察及预后判断[16-17]，对已确诊的肿瘤病人的预后与评价治疗效果有重要意义。

NMP22即细胞核有丝分裂器蛋白是核基质蛋白家族中的一种，于1980年首次发现并命名，在膀胱癌上皮细胞内的含量要比正常尿路上皮高数十倍。NMP22在细胞死亡后被释放到尿液中，以可溶性复合物或片段的形式存在于人的尿液中，与尿路上皮肿瘤密切相关。采用酶联免疫吸附试验可以检测其浓度[18]，这是NMP22作为临床诊断膀胱移行细胞癌的依据。公开资料表明：NMP22检测膀胱癌的总敏感性为73.2%～100%，特异性为85%～97%。更详细的分析表明：NMP22诊断Ta和T1期的膀胱癌敏感性为71%，特异性为93.8%；而在T2-4期的肿瘤，其敏感度可显著提高到92.6%，特异性93.8%[19]。美国FDA已经批准NMP22用于膀胱癌的检测，在检测膀胱癌的临床研究中显示了较高的性能。

TRFIA是一种新型的体外超微量分析定量技术。它采用具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合物为示踪物代替荧光物质、酶、同位素、化学发光物质，标记抗体、抗原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞，待反应体系（如：抗原抗体反应、核酸探针杂交、生物素亲和素反应以及靶细胞对效应细胞的杀伤反应等）发生后，用时间分辨荧光免疫分析检测仪测定反应产物中的荧光强度，根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析。它克服了酶标记物的不稳定、化学发光仅能1次发光且易受环境干扰、电化学发光的非直接标记等缺点，使非特异性信号降低到可以忽略的程度，达到了极高的信噪比，从而大大地超过了放射性同位素所能达到的灵敏度，且还具有标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点，成为90年代后非放射性免疫分析发展的新里程碑，正逐步推广到瘤标监测中[20]。

基于此，本研究团队拟利用铕（Eu3+）标记抗CEA单克隆抗体和钐（Sm3+）标记抗NMP22单克隆抗体，采用双抗体夹心法建立CEA/NMP22双标记TRFIA试剂，自行研制能同时检测人尿液CEA和NMP22的TRFIA试剂盒，本研究所研制的试剂盒测定结果显示，试剂盒CEA的灵敏度为 0.12 ng/mL，NMP22的检测灵敏度为0.21 U/mL。批内CV小于5%，批间CV小于10%，达到临床测试要求（批内CV＜10%，批间CV＜15%）；试剂盒检测样本浓度CEA蛋白的线性范围为0～600 ng/mL，NMP22蛋白的线性范围为0～1000 ng/mL，检测范围宽。此外，本试剂盒的灵敏度高，可同时联合检测CEA与NMP22两种肿瘤标志物，以期达到定量、快速、简便、敏感的对膀胱癌做出早期诊断。

[1]平秦榕, 颜汝平, 王剑松. 膀胱癌早期诊断方法的临床价值[J].医学与哲学, 2015, (6): 66-8, 97.

[2]Beckham CJ, Olsen J, Yin PN, et al. Bladder cancer exosomes contain EDIL-3/Del1 and facilitate cancer progression[J]. J Urol,2014, 192(2): 583-92.

[3]韩苏军, 张思维, 陈万青, 等. 中国膀胱癌发病现状及流行趋势分析[J]. 癌症进展, 2013, 11(1): 89-95.

[4]Pichler R, Fritz J, Heidegger I, et al. Gender-related outcome in bladder cancer patients undergoing radical cystectomy[J]. J Cancer, 2017, 8(17): 3567-9.

[5]Babjuk M, Oosterlinck W, Sylvester R, et al. EAU guidelines on non-muscle-invasive urothelial carcinoma of the bladder, the 2011 update[J]. Eur Urol, 2011, 59(6): 997-1008.

[6]Eissa S, Zohny SF, Shehata HH, et al. Urinary retinoic acid receptor-β2 gene promoter methylation and hyaluronidase activity as non-invasive tests for diagnosis of bladder cancer[J]. Clin Biochem, 2012, 45(6): 402-7.

[7]徐春国, 杨 彬. 膀胱肿瘤标记物的研究进展[J]. 医学与哲学,2012, 46(7): 40-1.

[8]Tilki D, Burger M, Dalbagni G, et al. Urine markers for detection and surveillance of non-muscle-lnvasive bladder cancer[J]. Eur Urol, 2011, 60(3): 484-92.

[9]Miyake M, Sugano K, Sugino H, et al. Fibroblast growth factor receptor 3 mutation in voided urine is a useful diagnostic marker and significant indicator of tumor recurrence in non-muscle invasive bladder cancer[J]. Cancer Sci, 2010, 101(1): 250-8.

[10]Yang N, Feng S, Shedden K, et al. Urinary glycoprotein biomarker discovery for bladder cancer detection using LC/MS-MS and Label-Free quantification[J]. Clin Cancer Res, 2011, 17(10): 3349-59.

[11]Yamada Y, Enokida H, Kojima S, et al. MiR-96 and miR-183 detection in urine serve as potential tumor markers of urothelial carcinoma: correlation with stage and grade, and comparison with urinary cytology[J]. Cancer Sci, 2011, 102(3): 522-9.

[12]Durant ST. Telomerase-independent paths to immortality in predictable cancer subtypes[J]. J Cancer, 2012, 3(1): 67-82.

[13]Ma HX, Zhou ZY, Wei S, et al. Shortened telomere length is associated with increased risk of cancer: a meta-analysis[J]. PLoS One, 2011, 6(6): e20466-8.

[14]Eckert MA, Lwin TM, Chang AT, et al. Twist1-induced invadopodia formation promotes tumor metastasis[J]. Cancer Cell,2011, 19(3): 372-86.

[15]Wadhwa N, Mathew BB, Jatawa SK, et al. Genetic instability in urinary bladder cancer: an evolving hallmark[J]. J Postgrad Med,2013, 59(4): 284-8.

[16]Washino S, Hirai M, Matsuzaki A, et al. Clinical usefulness of CEA,CA19-9,and CYFRA 21-1 as tumor markers for urotehlial bladder carcinoma[J]. Urol Int, 2011, 87(4): 420-8.

[17]Hegele A, Mecklenburg V, Varga Z, et al. CA19.9 and CEA in transitional cell carcinoma of the bladder: serological and immunohistochemical findings[J]. Anticancer Res, 2010, 30(12):5195-200.

[18]Li HX, Wang MR, Zhao H, et al. Comparison of fluorescence in situ hybridization, NMP22 bladderchek, and urinary liquid-based cytology in the detection of bladder urothelial carcinoma[J]. Diagn Cytopathol, 2013, 41(10): 852-7.

[19]Uehara M, Lapclk O, Hampl R, et al. Rapid analysis of phytoestrogens in human urine by time-resolved fluoroimmunoassay[J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 2000, 72(5): 273-82.

[20]L'homme R, Brouwers E, Al-Maharik N, et al. Time-resolved fluoro-immunoassay of plasma and urine 0-desmethylangolensin[J]. Steruid Biochem Mol Biol, 2002, 81(4/5): 353-61.