染色体核型分析与荧光原位杂交用于胚胎停育患者病因学诊断

何淑凤

无锡市妇幼保健院计划生育科，江苏 无锡 214000

稽留流产致病因素复杂，临床发现，既往有稽留流产史，再发稽留流产风险增高，反复妊娠失败给患者及家庭造成不良影响，因此寻找稽留流产确切病因成为重中之重，目前已知导致胚胎早期流产的主要原因是染色体异常，占比达50%～60%[1]。对于1次妊娠失败，患者急切希望了解此次妊娠失败的原因，通常先采用染色体核型分析技术明确是否染色体异常导致，但由于稽留流产，妊娠组织在宫腔内滞留时间长、胚胎坏死、机化，用于细胞培养的新鲜绒毛少之又少，加上细胞培养周期长、标本污染、清宫过程中混有母源组织影响等因素，培养失败率高，因此传统的染色体核型分析技术在稽留流产的病因诊断中有一定的局限性，它通常应运于产前诊断，来避免染色体异常患儿出生[2]。而荧光原位杂交技术（FISH）采用特有探针，检测过程中只要求靶细胞的细胞核完整，对样本要求低，而且不用担心标本污染、操作简单、方便快捷、敏感度高、特异性强，一定程度上提高了检测的效率和成功率[3]，目前在临床上应用增多[4]。但由于探针特异性，不能完全覆盖23对染色体，亦存在漏诊，有文献报道FISH的漏检率高达39.3%[5]，因此临床运用亦存在局限性。本研究通过收集78例胚胎停育患者妊娠组织，进行染色体核型分析及FISH检测，以期为胚胎停育患者查找原因找出更切合实际的检测方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年1月～2016年7月于本院计划生育病区住院的胚胎停育患者78例，B超检查明确胚胎停育，年龄23～44岁（29.26±4.72岁），停经时间75.31±11.40 d，孕次1.33±1.43次，胚胎停育次数0.59±0.76次，患者要求清宫术后对本次妊娠组织行细胞遗传学检测，签署同意书，在无菌条件下行清宫术，取出妊娠组织置于无菌生理盐水中固定，并立即送实验室。78例胚胎停育孕妇的妊娠组织中，38例培养成功，采用染色体核型分析，40例培养失败采用FISH检测。两组孕妇年龄、孕周及孕次差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。组间具有可比性。

表1 两组孕妇年龄、孕周及孕次比较 （Mean±SD）

1.2 方法

1.2.1 绒毛染色体培养 清宫术中取无菌妊娠组织物，肉眼选取绒毛组织，常规处理，细胞培养5～15 d，整个培养过程严格无菌。常规消化法收获细胞、制片、G显带。光镜下计数20个中期分裂相，分析3～5个染色体核型。按照《人类细胞遗传学命名国际体制（ISCN）》（2009）进行染色体核型命名。

1.2.2 FISH检测 临床上已有成熟的荧光DNA探针试剂盒（但探针仅有7种：13、16、18、21、22、X、Y染色体），按试剂盒说明操作，经变性、杂交、洗片、复染后在荧光显微镜下观察结果。正常染色体信号颜色：13/22均为2绿色；16/21均为2红色；18、X、Y染色体信号颜色分别为蓝色、绿色、红色。

1.3 数据处理

采用统计软件SPSS 22.0对数据进行处理，计数资料采用卡方检验，计量资料采用t检验，结果以均数±标准差表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 绒毛染色体核型分析及FISH检测结果

妊娠组织成功用于染色体核型分析者38例，其中检出正常核型23例，占60.53%（23/38），异常核型15例，占39.5%（15/38），异常核型中以染色体数目异常为主，常染色体三体占53.3%（8/15），三倍体1例，占6.67%（1/15），性染色体异常3例，占20%（3/15），结构异常3例，占20%（3/15）。40例染色体培养失败，采取FISH检测，全部检出，正常染色体15例，占37.5%（15/40），异常染色体25例，占62.5%（25/40），其中常染色体三体19例，占76.0%（19/25），三倍体2例，占8%（2/25），45XO 4例，占16%（4/25）（表2）。

2.2 胚胎停育患者年龄与染色体之间的关系

本研究中胚胎停育孕妇年龄≥35岁者12例，异常染色体占比83.33%（10/12），高于年龄＜35岁胚胎停育孕妇的异常染色体占比45.46%（30/66），差异有统计学意义（P＜0.05，表3）。

表2 38例绒毛染色体异常核型及40例绒毛细胞异常FISH检测结果

表3 胚胎停育患者年龄与染色体之间的关系

3 讨论

胚胎停育是一种病因复杂的疾病，临床上反复胚胎停育患者居多，有逐渐上升趋势，多次不良妊娠结局及清宫手术不仅给孕妇身体造成严重影响，如宫腔粘连，需进行多次手术分离粘连，而且迫于家庭及社会压力，孕妇极易有焦虑、挫败感、抑郁症等情绪。有研究评估了156例不良孕产史患者的心理状况，结果显示近一半存在焦虑情绪，其中以高龄及高学历为主[6]。高学历大多伴随高龄，研究结果亦证实高龄是唯一能够被证实的与染色体异常有关的因素[7]。本文对≥35岁及＜35岁异常染色体的对比研究中，发现差异有统计学意义，可能是由于随母体年龄增加，卵细胞老化从而导致卵细胞异常，最终导致染色体在减数分裂过程中出现了不分离。研究指出女性年龄本身不可能诱发卵母细胞减数分裂I期的同源染色体分离异常，而是由于随着年龄增加，卵母细胞内保障染色体精确分离的分子或者细胞学基础可能发生变化而导致染色体不能正确分离，进而引起染色体异常[8]。稽留流产由于其致病因素复杂，涉及因素众多，又相互关联，因此探究引起胚胎停育的原因时常采取排除法，若胚胎染色体正常，向其他方向查找原因。如若染色体异常，则考虑由于染色体异常导致的胚胎停育可能性大。染色体异常中，以数目异常最为多见。数目异常中，又以常染色体三体多见，约占50%～52%[9]。本研究78例稽留流产标本组织，采用常规的细胞培养+染色体核型分析，仅38例成功培养并分析，其中检出异常核型15例，异常核型中以染色体数目异常为主，常染色体三体占53.3%。40例染色体培养失败，采取FISH检测，全部检测成功，异常染色体25例，其中常染色体三体19例。考虑引起胚胎停育的主要原因是胚胎染色体异常，由于异常染色体所携带的基因失衡，从而阻止了其正常发育进程，在孕早期以稽留流产、自然流产、死胎等形式自然淘汰。也有少数染色体异常胚胎可以存活至出生，但或多或少合并脏器畸形或智力缺陷。

本文染色体核型分析及FISH检出数目异常率分别为39.5%、62.5%，均低于文献报道率，两种检测方法比较差异有统计学意义。因FISH检测技术对标本要求低，使得检测成功率方面较传统染染色体核型分析技术更胜一筹。临床常见的常染色体数目异常有9、13、14、15、16、18、21和22三体。其中16三体占比高达20%～30%[10]，本文通过染色体核型分析及FISH检测技术，发现16三体占比分别为2.63%、7.5%，可能与样本量少有关，后续需积累并增加样本量，进一步研究。想要了解胚胎停育患者是否由于染色体异常导致妊娠丢失，目前临床上通常采用胚胎绒毛染色体核型分析技术及荧光原位杂交技术，这两项检测技术各有其优缺点，染色体核型分析较为传统，它是遗传学检验的基础，可以对整个染色体组进行数目及结构上的分析，但难以发现小片段的染色体重排。培养过程中，对样本要求高，要求样本严格无菌、新鲜，有存活细胞，但由于胚胎停育患者绒毛组织宫腔内滞留时间长、通常绒毛陈旧变性、坏死，血凝块夹杂杂质较多，且细胞活力差，宫内及手术操作、培养过程中的细菌污染，容易导致培养失败，有报道细胞培养失败率为5%～42%[11]，概率区间较大，可能与各实验室检验人员技术及实验室条件不同有关。绒毛细胞培养需要7～14 d[12]，单个样本细胞培养+染色体核型分析诊断时间约为30 d[13]，即使存在各种制约条件，但目前临床上使用最多最基本的遗传学检查仍是染色体核型分析，对于染色体结构异常、低比例嵌合体仍有不可替代的优势。FISH检测是利用荧光标记的特定的DNA探针与靶细胞DNA片段杂交，用特殊的荧光显微镜观察杂交信号，从而对待测核酸进行定性、定位及定量分析[3]。它操作简单，无需标本无菌，不仅能检测出染色体结构异常，亦能判断出染色体嵌合现象[14]。但因特异性探针的制约，临床只能检测到常见的7对染色体的数目异常，如常见的21三体、18三体、13三体及性染色体异常，然而人类胚胎非整倍体异常的发生几乎覆盖所有染色体；单个FISH探针难以检测出染色体局部不平衡；不能辨别母细胞污染的女性胎儿标本；并且还存在一定的假阴性与假阳性[15]。因杂交失败或非特异杂交、杂交信号重叠或距离过近导致错误判读等缺点[16]，因此临床应用具有一定的局限性。目前临床上没有绝对好的检测方法，只有依据病情及实际情况，在传统遗传学检测方法的基础上，结合其他先进的检测方法才是最适合的。特别对多次胚胎停育及迫切需要孕育正常小孩的患者，建议行辅助生殖技术助孕，对胚胎进行植入前诊断，从源头上发现并解决问题，以期增加正常妊娠机会。目前，随着科学技术的发展，临床上常见的胚胎植入前遗传学筛查技术手段繁多，如比较基因组杂交(array-CGH)、单核苷酸多态性阵列、多元定量PCR和下一代测序。有研究证实了PGS可增加胚胎植入及临床受孕率，降低流产率等[17]。但PGS需要侵入性胚胎活组织检查，有文章已证实侵入性取材，可降低胚胎质量[18]。甚至有动物研究显示，在子代神经和肾上腺发育方面亦存在不良影响[19]。FISH技术作为最初的植入前诊断技术，因对胚胎有创，而且对改善临床结局无益[20]，目前被搁浅。近期发展起来的无创胚胎染色体筛查技术通过提取培养液中游离的极微量的DNA，采用单细胞全基因组扩增技术实现对胚胎染色体的全面筛查，从而选择染色体正常的胚胎进行移植[21]，减少不良妊娠，作为一种新技术被寄予厚望。

[1]乐 杰. 妇产科学[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2004: 89-92.

[2]郭芬芬, 徐 盈, 陈必良, 等. 934例绒毛染色体核型分析[J]. 中国产前诊断杂志电子版, 2016, 8(1): 23-6.

[3]吴伟晴, 吴 炎, 钟晓茹, 等. 荧光原位杂交技术检测145例胚胎停育患者绒毛染色体异常分析[J]. 中国优生与遗传杂志, 2016,24(3): 40-1.

[4]雷 琼, 王 琼, 周灿权. 不同分子遗传学方法用于自然流产绒毛细胞遗传分析的效果[J]. 中华妇产科杂志, 2009, 44(4): 253-6.

[5]吕杰忠, 杜 涛, 张嘉宁, 等. 荧光原位杂交和染色体核型分析诊断自然流产胚胎染色体畸变的对比研究[J]. 中华医学遗传学杂志, 2014, 31(6): 803-4.

[6]吕 巍, 曹欣冬, 周 衡. 不良孕产史患者焦虑状态研究[J]. 首都医科大学学报, 2013, 3(45): 752-5.

[7]Pacchierotti F, Adler ID, Eichenlaub-Ritter U, et al. Gender effects on the incidence of aneuploidy in mammalian germ cells[J].Environ Res, 2007, 104(1): 46-69.

[8]史庆华, 张坚宣, 潘淑娟, 等. 用GT重复多态性诊断21三体患者中超数21号染色体减数分裂起源的研究[J]. 遗传学报, 1998, 25(6):478-84.

[9]马玲利, 丛 林, 袁 静, 等. 100例早孕胚胎停育绒毛染色体核型分析[J]. 中国妇幼保健, 2011, 26(26): 4104-5.

[10]雷彩霞, 张月萍. 1437例早孕期自然流产胚胎核型分析[J]. 生殖与避孕, 2014, 34(4): 328-31.

[11]杨 锴, 祝建疆, 戚 红, 等. 1389例稽留流产绒毛细胞染色体核型分析[J]. 中国优生与遗传杂志, 2014, 22(7): 53-4.

[12]常 亮, 张秋芳, 李 丹, 等. 荧光原位杂交与染色体核型分析应用于自然流产病因学诊断的比较研究[J]. 生殖与避孕, 2013,33(2): 73-7.

[13]Lathi RB, Loring M, Massie JA, et al. Informatics enhanced SNP microarray analysis of 30 miscarriage samples compared to routine cytogenetics[J]. PLoS One, 2012, 7(3): e31282-4.

[14]Papavassiliou P, York TP, Gursoy N, et al. The phenotype of persons having mosaicism for trisomy 21/Down syndrome reflects the percentage of trisomic cells present in different tissues[J]. Am J Med Genet A, 2009, 149A(4): 573-83.

[15]Mann K, Donaghue C, Fox SP, et al. Strategies for the rapid prenatal diagnosis of chromosome aneuploidy[J]. Eur J Hum Genet, 2004, 12(11): 907-15.

[16]华 芮, 全 松. 植入前遗传学筛查技术争议与重新认识[J]. 中国实用妇科与产科杂志, 2016, 32(3): 240-5.

[17]Scott RT, Jr. Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: A randomized controlled trial[J]. Fertil Steril, 2013, 100(3):697–703.

[18]Danilo C, Antonio C, Filippo MU, et al. The impact of biopsy on human embryo developmental potential during preimplantation genetic diagnosis[J]. Biomed Res Int, 2016, 71(9): 3075-9.

[19]Wu Y. Blastomere biopsy influences epigenetic reprogramming during early embryo development, which impacts neural development and function in resulting mice[J]. Cell Mol Life Sci,2014, 71(9):1761–74.

[20]Palini S, De Stefani S, Primiterra MA. Pre-implantation genetic diagnosis and screening: now and the future[J]. Gynecol Endocrinol, 2015, 31(10): 755-9.

[21]Xu J, Fang R, Chen L, et al. Noninvasive chromosome screening of human embryos by genome sequencing of embryo culture medium for in vitro fertilization[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2016,113(42): 11907-12.