川藏公路拉萨-林芝沿线藏猪大肠杆菌血清型调查及耐药性检测

王润锦，陈 羲，马金英

（1.西藏自治区山南市畜牧兽医总站，西藏 山南 856100；2.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏 拉萨 850009）

大肠埃希氏菌（Escherichia coli）通常被称为大肠杆菌，是人和动物肠道共生菌，可以作为社区和农场中各种细菌耐药性发生情况的指标菌，而藏猪主要分布于雅鲁藏布江流域中游河谷区和藏东三江流域中游海拔为3 500 m左右的气候条件恶劣的高原地带，是我国唯一的高原猪种[1-2]。藏猪具有肉质优良、耐严寒、耐粗饲、抗逆性强等优点。但随着川藏公路拉萨-林芝沿线藏猪养殖业的发展，藏猪养殖初具规模化，一些传染性疾病也日渐严重，给养猪业造成不小经济损失。对藏猪源大肠杆菌和肠球菌开展耐药性调查及其耐药机制研究，在兽医及人医领域均有重要的公共卫生意义[3]。笔者于2016年8月对拉萨-林芝公路沿线12个乡镇藏猪采集直肠棉拭子共计1 200份，分离出了大肠杆菌，在此基础上进一步做了菌株分离及耐药性的检测，结果如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 拉萨-林芝公路沿线蔡公堂乡、章多乡、甲玛乡、工卡镇、扎西岗乡、日多乡、加兴乡、金达镇、巴河镇、百巴镇、更章门巴民族乡、八一镇为采样点，采集被检藏猪直肠棉拭子1 200头份，保存于1 mL营养肉汤的灭菌医用配离心管，车载冰箱4℃保存。标明样品采集时间、地点、编号。

采样原则：每个采样点分别采集1岁以上藏猪直肠棉拭子40头份、断奶仔藏猪60头份。

1.1.2 标准菌株 大肠杆菌（ATCC25922）购于杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.3 细菌培养基及配制 普通营养肉汤培养基购于广东环凯微生物科技有限公司。称取营养肉汤粉末18 g，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌15 min，待冷至常温，备用。

麦康凯琼脂培养基购于广东环凯微生物科技有限公司。称取麦康凯琼脂粉末55 g，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌15 min。待培养基冷至50～55℃倾注灭菌平皿，待凝固后，备用。

科玛嘉®大肠杆菌显色培养基（ECC）购于博赛生物技术股份有限公司。取瓶内干粉37.3 g溶于1 000 mL去离子水的洁净三角瓶中，充分搅拌混匀，高压灭菌（121℃，15 min）。加热后的培养基冷却至45～50℃，轻轻地摇动均匀，倾注平皿，使其凝固，晾干备用。

伊红美兰琼脂培养基（EMB）购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。称取伊红美兰琼脂培养基粉末42.5 g，加热溶解于1 000 mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15 min，备用。

LB营养琼脂培养基平板购于上海凡仪科技发展有限公司。

1.1.4 大肠杆菌API-20E生化鉴定试纸条 生化反应鉴定试纸条API-20E购于法国梅里埃生物技术有限公司，用于肠杆菌属细菌的快速生化鉴定。

1.2 方法

1.2.1 大肠杆菌的分离和初步鉴定 用无菌接种环蘸取少量被检藏猪直肠棉拭子的营养肉汤，划线接种在麦康凯琼脂平板上，37℃恒温培养16～18 h，挑取红色或粉红色的单菌落（每个样本挑取一个），在LB肉汤中37℃培养18 h左右，取菌液划线接种于ECC显色培养基，在37℃培养18～24 h，观察菌落形态，呈现光滑、边缘整齐、直径为1～2 mm的蓝色或绿色圆形菌落可初步判断为大肠杆菌[4]。

1.2.2 大肠杆菌API-20E试纸条的生化鉴定 将少量可疑细菌接种于API-20E试纸条，培养20 h左右，加入相应显色试剂后观察其颜色的变化，根据说明表判读反应，参照分析图索引和APLAB PLus软件得到鉴定结果。

1.2.3 致病性试验 将生化反应特征符合大肠杆菌的菌株接种营养肉汤，37℃培养18 h后，分别腹腔接种小白鼠，0.2 mL/只，观察存活情况。剖检死亡小白鼠，取其脏器用伊红美兰培养基进行种菌回收试验，其培养特性、形态、染色反应均符合大肠杆菌，判定为致病性大肠杆菌[3，5]。

1.2.4 大肠杆菌O抗原血清型鉴定 将经分离鉴定为致病性大肠杆菌的菌株接种于普通琼脂培养基上，进行纯培养，用少量0.5%石炭酸生理盐水洗下菌落，制成浓稠菌悬液，121℃高压灭菌2 h，破坏K抗原，冷却后用微量移液器吸取25 μL与等量标准血清进行玻片凝集试验，5 min内出现明显凝集者为阳性反应，同时以生理盐水作对照，观察有无自凝现象[5-6]。

1.3 药敏试验

青霉素、庆大霉素、诺氟沙星、左氟沙星、阿莫西林、卡那霉素、环丙沙星、氟苯尼考、先锋霉素9种药，按照常规药敏纸片扩散法进行操作，并根据抑菌圈直径（Ф）判定药物敏感性，Ф≥20 mm为高度敏感，15 mm≤Ф＜20 mm为中度敏感，Ф＜15 mm为耐药。

2 结果

2.1 分离菌株鉴定结果

从拉萨-林芝公路沿线蔡公堂乡、章多乡、甲玛乡、工卡镇、扎西岗乡、日多乡、加兴乡、金达镇、巴河镇、百巴镇、更章门巴民族乡、八一镇采集被检藏猪直肠棉拭子1 200头份的样品中，共分离鉴定出99株致病大肠杆菌菌株。其培养特性及染色、生化反应特征为：革兰氏染色均为革兰氏阴性杆菌；在普通肉汤中呈均匀混浊，液面有菌膜，管底有白色沉淀，振荡呈云雾状散开；普通琼脂平板上生长呈灰白色、半透明、表面隆起、光滑湿润、边缘整齐的圆形菌落，直径1～3 mm；麦康凯培养基上生长呈粉红色菌落；ECC培养呈蓝色；伊红美兰培养基上生长呈紫黑色带金属光泽菌落；API-20E试纸条的生化鉴定为大肠杆菌。

2.2 菌株血清型鉴定结果

用50种O抗原血清对99株分离株进行血清型鉴定，除14株未鉴定出血清型外，其余85株血清型 分 属 于 O21（15/85）、O9（12/85）、O101（9/85）、O18（9/85）、O85（9/85）等22个血清型（表1）。其中O21、O101、O18、O9、O85有54株，共占所鉴定分离菌株的63.53%（54/85），这几种血清型均为拉萨-林芝公路沿线目前流行的主要血清型。

表1 猪大肠杆菌分离菌株血清型鉴定结果

2.3 药敏试验结果

药敏试验结果发现，拉萨-林芝公路沿线蔡公堂乡、章多乡、甲玛乡、工卡镇、扎西岗乡、日多乡、加兴乡、金达镇、巴河镇、百巴镇、更章门巴民族乡、八一镇不同乡镇分离获得的藏猪大肠杆菌致病菌株对药物的敏感性差异较小。对卡那霉素、环丙沙星、氟苯尼考、先锋霉素4种药高度敏感，对庆大霉素、诺氟沙星、左氟沙星、阿莫西林中度敏感，对青霉素耐药。其中77.13%的菌株对青霉素耐药，对庆大霉素、诺氟沙星、左氟沙星、阿莫西林耐药的菌株分别为19.47%、18.10%、17.77%和15.39%。

3 讨论

大肠杆菌引起的仔猪下痢仍然是导致藏猪养殖业经济效益较差的重要原因之一，长期困扰着藏猪养殖业的发展。在当地兽医指导下，经药物治疗后虽然仔猪死亡率不高，但常引起发病仔猪生长发育迟缓、生产能力低下，给拉萨-林芝公路沿线藏猪养殖业造成严重的经济损失。

77.13%的菌株对青霉素耐药，说明拉萨-林芝公路沿线藏农牧民经常盲目给发病猪使用青霉素，致使大肠杆菌产生耐药。对发病藏猪，在确诊的基础上，与相关教学科研单位协作，通过药敏试验，有目的、有针对性地用药，且用药应有足够疗程和剂量，尽量减少耐药菌株产生[5，7]。

选择适合本地血清型的大肠杆菌疫苗，方能有效预防本病发生。在血清型鉴定中发现，O21、O101、O18、O9、O85有 54株，共占所鉴定分离菌株的 63.53%（54/85），即这几种血清型是拉萨-林芝公路沿线目前流行的主要血清型。不同区域流行菌株血清型差异较大，而且同一藏猪养殖较为集中的乡镇也存在多种血清型，因此，在大肠杆菌的免疫预防中，应充分考虑其血清型的多样性、易变性[7]，尤其是藏猪养殖较为集中的乡镇最好每年进行一次血清分型鉴定，以便有针对性地进行免疫。

[1]强巴央宗，谢庄，田发益.高原藏猪现状与保种策略[J].中国畜牧杂志，2001，37（6）：46-47.

[2]唐建华，冯静，陈晓英，等.藏猪种质资源保护与利用研究[J].养猪，2016（1）：68-70.

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[4]李鹏.藏猪源大肠杆菌和肠球菌耐药性调查及其耐药机制的研究[D].北京：中国农业大学，2015.

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[6]陆承平.兽医微生物学[M].第5版.北京：中国农业出版社，2013：78-86.

[7]严亮.大肠杆菌多重耐药株的体外诱导初步研究[J].畜牧与饲料科学，2015，36（4）：15-17.