杜氏肌营养不良症生物学治疗的研究进展

刘 悦，马沛沛，吴士文

杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一种致死性的X连锁隐性肌肉变性疾病，其发病是由抗肌萎缩蛋白基因移码突变所致。如不接受治疗，DMD患儿在10岁左右丧失行走能力，大多数患儿最终卧床不起，并发关节挛缩、褥疮、肺炎，而在20岁前死亡。在过去几十年中，凭借着糖皮质激素（glucocorticoids，GCs）的应用[1]，多学科综合护理水平的提高，心脏和呼吸系统并发症的处理，DMD的病程发展发生了显著改变，男性患病可生存至30～40岁。由于临床对已出生DMD患者治疗措施有限，因此，研究者们已将治疗战略从针对疾病修饰途径的药理学治疗逐步扩展到纠正潜在基因突变的生物治疗，如依靠胚胎植入前遗传学诊断、产前诊断技术的发展预防患病胎儿出生。现将DMD生物学治疗进展作一综述。

1 针对致病基因

1.1 靶向致病基因脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA） （1）基因替代疗法目前具有很大潜力，具体操作为通过将功能性DMD基因转移到DMD患者的骨骼肌、心肌细胞，从而恢复其抗肌萎缩蛋白。然而，dystrophy全基因组长度达2.3 Mb，难以被多数病毒基因载体包装运载。有研究发现在mdx小鼠模型局部注射的小型肌萎缩蛋白，尽管缺少约70%的编码序列，但仍可保护mdx小鼠的四肢肌肉和心脏[2,3]。同样，在贝克肌营养不良症（Becker muscular dystrophy，BMD）患者中，研究发现注射小型或微型抗肌萎缩蛋白可使患者临床症状减轻[4]。基于上述证据，腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）介导的微型抗肌萎缩蛋白基因治疗应运而生。研究表明微型抗肌萎缩蛋白基因治疗可降低DMD动物模型肌酸激酶（creatine kinase，CK）水平并显著改善其肌肉萎缩表现[3]。（2）基因定向编辑。成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspersed short palindromic repeats，CRISPR）是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，其上游还有一个多态性的家族基因，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域发生作用。因此，该基因被命名为CRISPR关联基因（CRISPR associated，Cas）。CRISPR/Cas系统可识别外源DNA，并将它们切断以沉默外源基因的表达，正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。其中，CRISPR/Cas9系统是研究最深入、应用最成熟的一类。当Cas9的内切核酸酶与向导核糖核酸（guide Ribonucleic acid，gRNA）链结合时，可精确切割基因组[5]。体外研究表明，CRISPR / Cas9技术可用于许多不同的突变，包括占DMD突变谱12%～15%的多外显子重复[6]。根据大多数重复区域头尾结构，一个gRNA就可去除突变并恢复全长抗肌萎缩蛋白，AAV载体的限制就不再是问题。且Long等[7]已在mdx小鼠模型中证明了CRISPR / Cas9介导恢复体内DMD开放阅读框的治疗潜力。

1.2 靶向致病基因核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）DMD基因突变中外显子缺失突变最常见，占55%～65%。缺失突变包括移码编码和整码突变两种类型，移码突变破坏了开放阅读框，从而导致患者不能产生抗肌萎缩蛋白。整码突变虽然也破坏了开放阅读框，但可产生缩短的、有一定功能的抗肌萎缩蛋白，导致临床症状较轻的BMD。外显子跳跃技术是通过引入跳过一个或多个靶向外显子的替代剪接位点，将DMD患儿的移码突变类型修改为整码突变类型，这样就有可能使临床症状较重的DMD转换为症状较轻的BMD[8]。反义寡核苷酸是一种修饰合成的核酸链，其长度通常为20～30个核苷酸，由抗肌萎缩蛋白前体信使RNA（messenger RNA，mRNA）的互补序列组成，通过与mRNA上要去除的外显子剪切序列杂交，干扰剪切机制，从而导致该外显子跳跃来恢复阅读框。目前，已有多种反义寡核苷酸被开发合成。

外显子 45～50，47～50，48～50，49～50，50，52 或 52～63缺失所致的移码突变均可通过跳跃51号外显子转变为整码突变，这将治疗大约13%的DMD患者[8]。2'O-甲基低聚核糖核苷硫代磷酸酯（2'O-methyl-ribo-oligonucleosidephosphorothioate，2'OMePS）和磷酸二酰胺吗啉低聚物（phosphorodiami-date morpholinooligomers，PMOs）是两种靶向外显子51的寡聚体，但其生物化学结构、对内切核酸酶的稳定性和毒性特征均不同。一系列临床前研究成功验证了2'OMePS和PMOs在DMD治疗中的潜力[9,10]。其中，Yokota等[10]发现对肌营养不良犬模型进行肌内注射2'OMePS和PMOs可介导有效的外显子跳跃，增加抗肌萎缩蛋白表达，改善其临床表型。随后，研究者们对2'OMePS寡聚物（drisapersen）和PMO（eteplirsen）进行了一系列系统的临床试验。在一个为期48周的研究中，18名患者以每周6 mg/kg的剂量皮下施用drisapersen（连续方案）；另一组17名患者则在6周内接受了9次注射，然后中断4周（间歇性方案）；第三组18名患者接受安慰剂治疗。24周后，相比安慰剂组，连续方案组患者步行距离显著增加（约35 m）。但由于研究结果显示药物的改善作用不够突出，且出现了蛋白尿等不良反应[11]，目前该试验已被取消。在一项纳入12名DMD男孩的双盲试验中，一组接受每周一次30 mg/kg eteplirsen静脉给药，另一组接受每周一次50 mg/kg eteplirsen静脉给药；第三组给予安慰剂。48周后，eteplirsen组与对照组相比，行走距离均延长，活检中抗肌萎缩蛋白增加了40%～50%，并且该药耐受性良好[12]。2016年美国食品药品监督管理局宣布如果该药能成功完成，且完成药物上市后公司承诺的其他额外试验[13]，将加速批准eteplirsen的临床应用。

1.3 靶向致病基因编码蛋白 约15%DMD具有提前终止密码子，这导致了DMD的mRNA衰变和/或蛋白质翻译的过早停止，最后产生截短的、无功能的蛋白质。ataluren（PTC124，商品名Tranlsarna）能够降低核糖体对过早终止密码子的敏感性，造成所谓“终止密码子通读”[14]，使含有无义突变的基因产生功能性蛋白。但是，目前ataluren的作用机制尚存在争议[15]。

2014年，欧洲药品管理局和欧洲委员会批准Translarna品牌药物用于治疗无义突变的DMD患者。Bushby等[16]在同年进行了一项随机双盲多中心试验，纳入173名年龄5～20岁的DMD患者。治疗48周后，口服ataluren 40 mg/（kg·d）的研究对象（步行距离仅下降13 m）与安慰剂组相比（下降44 m）下降更为缓慢，且过程中未报告严重不良事件。2017年完成的第二个atalurenⅢ期临床试验未能达到预期的稳定6 min步行距离，且大部分DMD患者无显著症状改善[17]。但对第一次和第二次试验结果的荟萃分析显示，用药后在临床症状改善和统计数据上均显示患者受益，特别是对6 min步行距离测试成绩300～400 m的患者，治疗效果显著[18]。基于以上结果，该类药物的后续试验已在多个国家启动。

1.4 靶向相关信号通路/分子 抗肌萎缩蛋白缺失会导致肌细胞膜小的断裂和撕裂，随着时间推移导致膜不稳定性增加，关键离子梯度改变和第二信使路径破坏。许多治疗方法试图改善膜稳定性或改变肌肉内因抗肌萎缩蛋白缺失干扰的第二信使信号传导途径，另外，将失调的细胞内途径正常化也是目前的研究策略之一。例如，肌浆网/内质网钙三磷酸腺苷酶1的基因上调对mdx小鼠表型慢性钙调节及改变兴奋性收缩耦合和钙稳态的兰尼碱受体（ryanodine receptor，RyR）中RyR1、RyR2的翻译产生影响[19]，同样，已有研究证明药物Rycals有利于改善FK506结合蛋白与RyR的结合[20]。另一个重要的信号级联是肌肉生长抑制素和骨桥蛋白参与的典型和非典型转化生长因子-β信号传导，也已被证明在肌肉再生和组织纤维化形成中发挥作用[21]。调节转化生长因子-β信号的治疗，如抑制肌生长抑制素，同样是目前是临床试验的热点。其他关键的下游途径包括核因子κB和抗炎信号及靶向线粒体的化合物功能和组蛋白脱乙酰酶抑制剂也在进行相应的研究中[22,23]。

1.5 其他 抗肌萎缩蛋白曾被认为只存在于肌纤维中。但近年Rudnicki及其团队发现，其在肌肉干细胞中也可表达[24]。应用CRISPR/Cas9对肌肉干细胞的基因进行编辑也是目前的研究热点。如何准确靶标肌肉干细胞，目前的方法仍需进一步改进。同时利用iPS细胞技术结合转录激活因子样效应物核酸酶或CRISPR纠正DMD基因突变的可能性尽管已在实验室得到验证[25]，但因可编程的核酸酶有致有害突变的可能，目前仍无法应用于临床。

2 针对临床表型

2.1 上调抗肌萎缩蛋白替代蛋白 Utrophin蛋白是一种和抗肌萎缩蛋白具有相似组织结构和蛋白质结合性质的同系物，分子量为395 kDa。Utrophin上调曾经是DMD分子治疗中首先被考虑的方法之一。Utrophin在子宫肌膜中无处不在，肌肉成熟时逐渐被抗肌萎缩蛋白取代。在成人肌肉中，Urophin在神经肌肉和肌腱结中可见。在DMD患者和mdx小鼠模型的肌肉修复中观察到，由于抗肌萎缩蛋白的缺失，Utrophin表达自然增加，以重建肌肉纤维的连续性[23]。尽管两种蛋白质之间存在一些不同的功能特征，但已有研究表明，Utrophin可在mdx小鼠肌肉中起到有效的替代作用。而ezutromid被发现具有上调Utrophin蛋白表达的作用，且已在健康志愿者身上证明其安全性[26]。ezutromid应用于DMD患者的有效性和安全性研究目前正在进行中，这项历时48周的试验招募了40名来自美国和英国的5～10岁男患儿，并将其分成两组，各2次/d接受两种ezutromid制剂中的一种，以确定哪种制剂将在未来的临床试验中使用。试验目前已进行至24周，通过肌肉活组织检查发现，与基线相比，两组肌肉损伤明显减少，并伴有Utrophin蛋白的增加。

2.2 修复/重新密封受损细胞膜 Houang等[27]一直致力于开发一种修复/重新密封DMD中损伤肌细胞膜的膜聚合物。在mdx小鼠和DMD狗模型中，候选药物之一的泊洛沙姆P188已显示出在修复/改善心肌病方面的潜力。另一种基于上述治疗策略的分子是层粘连蛋白-111，它是一种天然存在的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）蛋白，功能是促进ECM和肌膜之间的相互作用。有研究发现，肌内注射或全身注射层粘连蛋白-111可改善mdx小鼠的肌营养不良表型[25]。但与P188一样，层粘连蛋白-111也面临着与药物传递和分布相关的挑战，这两种药物都尚未进入临床试验。

总之，DMD的治疗在过去十年中发生了巨大的变化，整体前景令人期待，但由于DMD病因复杂，将这些从各角度发现的治疗方法转化并运用于临床仍需克服许多障碍。未来仍需多学科协同、组合治疗共同改善DMD的临床症状和整体生活质量。

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