核桃肽生物活性的研究进展

珠 娜，李 勇

(北京大学医学部公共卫生学院，北京 100191)

核桃美味且营养丰富，其对心血管疾病、冠心病及神经失调的有益作用已获得学术界公认[1-6]。核桃蛋白质氨基酸种类齐全，含有人体必需的8种必需氨基酸，与动物蛋白质相近，是优质蛋白质的重要来源[8]。然而，与核桃蛋白质相比，其水解产物核桃肽具有高浓度、低粘度，溶解性好，还原能力强及对pH变化相对稳定等良好的特性，在起泡性、乳化性及吸油性等方面也优于核桃蛋白，逐渐成为研究热点[9-12]。

1 核桃肽的制备

目前，多肽的制备方法主要有水解法(酸水解、碱水解、酶水解)、分离提取法、化学合成法、基因重组法、微生物发酵法。分离提取法因受到食物多肽含量的限制，其得率和生产率不理想。化学合成法主要用于制备短肽，其成本高、副反应多。基因重组法主要是制备较大的肽段，但其相关技术尚未成熟。微生物发酵法能合理利用资源是最为经济的方法，但是对微生物的选择有着严格的要求，且要考虑安全问题。相比之下，酶水解法因其反应条件温和、酶的专一性高、产品纯度高、水解效率高等优点成为制备多肽的主要方法。核桃肽的制备也主要用酶水解法。酶水解法对酶的专一性有较高的要求，对多肽的制备至关重要。核桃肽的制备中常用的酶有中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等。此外，也有许多研究证实，复合酶的水解作用更强，可提高产物的生产率[13-14]。

多肽的制备过程中，酶解条件起着重要的作用，与多肽的功能及生物活性密切相关。适度的延长反应时间会使酶和底物充分反应，但一定时间后水解度的增加并不明显[14]。刘昭明等[15]采用正交试验制备核桃蛋白的中性蛋白酶水解肽，发现温度40℃、底物4%、加酶量4 000U/g、pH 8.0时其水解度最佳。包怡红等[16]以风味蛋白酶为酶制剂水解核桃蛋白，发现温度55℃、底物10%、加酶量1.5%、pH 6.5、反应时间2h时其水解度最佳。刘威等[17]采用碱性蛋白酶水解核桃清蛋白，其最佳酶解条件为温度45℃、底物4%、加酶量8 000U/g、pH 9.5、反应时间2h。李艳伏等[18]以木瓜蛋白酶水解核桃蛋白在温度55℃、底物3%、加酶量6 000U/g、pH 7.5、反应时间3.5h时获得了具有抗氧化功能的核桃肽。

2 核桃肽的生物活性

2.1 核桃肽的抗氧化活性研究

生物活性肽的抗氧化活性与其氨基酸序列有关，用特异性蛋白水解酶可以制备抗氧化肽段[17，19-20]。核桃多肽抗氧化方面的动物实验研究较少，主要涉及体外试验，检测其清除二苯代苦味酰基自由基(DPPH)，羟自由基(·OH)、超氧阴离子(O2-·)、ABTS+·自由基的清除能力[21]及总抗氧化能力、Fe2+螯合能力、亚油酸过氧化能力[22]。刘威等[17]用碱性蛋白酶水解核桃清蛋白，在pH 9.5、温度45℃、底物浓度4%、加酶量8 000U/g的条件下水解2.5h，获得抗氧化活性肽并证实其对·OH、DPPH·、ABTS+·3种自由基的清除能力及对Fe2+的螯合能力。李艳伏等[18]在6 000U/g底物、底物质量分数3%、pH 7.5、温度55℃的酶解条件下用木瓜蛋白酶酶解核桃粕蛋白，发现210min时酶解液的抗氧化活性较高，OH·清除率为55.43%，O2-·清除率为64.23%，DPPH·清除率为79.32%，总抗氧化能力为98.74%单位/mL。而且，确定具有抗氧化功能的多肽分子质量主要集中在1 321～607Da之间。郝常艳等[14]用中性蛋白酶在酶浓度9 999.99U/g、底物浓度10%、温度50.07℃、pH 7.21的酶解条件下水解核桃蛋白所得到的抗氧化活性肽进行小鼠体内抗氧化实验，发现核桃肽可以增强小鼠体内过氧化物歧化酶(GXH-Px)活性、降低丙二醛(MDA)含量。通过体外试验及体内动物实验可以证明核桃肽具有良好的抗氧化活性。

2.2 核桃肽的降血压活性研究

20世纪60年代中，Ferria等[23-24]从西蝮蛇毒液中首次提取出具有降压活性的寡肽，命名为舒缓激肽增强肽。后来研究者根据该寡肽的降压原理合成了第一个口服降压药卡托普利[25]。降压活性肽的研究越来越受研究者的关注，且随着药食同源的提出，降血压活性肽主要来源于食源性物质，其安全性高、作用温和，而且对正常人没有降压作用。降压活性肽主要是通过抑制血管紧张素转化酶(ACE)达到降压的目的。血管紧张素原被肾素水解产生血管紧张素Ⅰ，进一步在ACE的作用下转化成血管紧张素Ⅱ发挥收缩血管的作用。降压活性肽抑制ACE，阻断后续一系列反应，从而起到降压作用，因此又被称为ACE抑制肽[26-27]。食物源性ACE抑制肽有很多，舒国伟等[28]以羊乳为原料，发酵法和酶解法制备出了羊乳源性ACE抑制肽。Shin等[29]将大豆蛋白中分离出的活性肽注射给自发性高血压大鼠，发现可以显著降低收缩压。

ACE抑制肽的活性检测方法有体内试验和体外试验。体内试验包括紫外分光光度法、荧光分光光度法、高效液相色谱法。体外试验主要是通过对自发性高血压大鼠给予ACE抑制肽，比较干预前后血压变化来评价其活性大小[26]。目前，尚无核桃肽降血压的体内试验的研究报道，其活性研究主要是体外试验。姜莉等[30]在酶用量6 000U/g、底物质量分数3%、pH 7.5、温度50℃的酶解条件下，木瓜蛋白酶水解核桃蛋白240min，发现酶解液的ACE抑制率较高达88.86%。刘猛等[31]发现，以制油后的核桃渣为原料，将其用中性蛋白酶水解，并进一步超滤、凝胶过滤层析、离子交换层析、高效液相色谱法分离提取的活性肽有显著的降压活性。

2.3 核桃肽提高免疫活性研究

食物与机体免疫功能密切相关，食物所提供的某些活性营养物质可以调节免疫功能，例如紫菜、香菇等[32-36]。近年来，有许多研究报道，食物蛋白水解物-肽有良好的免疫调节作用。许丹等[37]发现，牡蛎肽可以改善免疫抑制小鼠的免疫系统紊乱[37]。杨睿悦等[38]发现，海参蛋白肽可以增强小鼠免疫功能。这些生物活性肽被称之为免疫调节肽，其免疫调节作用的机制尚不清楚，一般是通过增强淋巴细胞增殖和抗体生成达到免疫调节的目的[39-41]。核桃蛋白作为优质的植物蛋白来源，研究发现，其水解物核桃肽也有显著的免疫调节作用。李汉洋等[42]发现，核桃多肽对小鼠淋巴细胞有增殖作用。崔玲玉等[43]研究发现，山核桃蛋白及其水解物均提高胸腺和脾脏指数，增强巨噬细胞吞噬能力、脾脏T淋巴细胞增值能力、增加小肠内容物IgA的浓度，显著增强小鼠免疫功能。崔犁等[44]发现，核桃蛋白中性蛋白酶水解物可以增强脾淋巴细胞增殖及其分泌白细胞介素-2、巨噬细胞功能及其产生NO的功效。

2.4 核桃肽抗疲劳活性研究

疲劳的产生机制主要涉及能源物质的消耗、代谢产物的堆积、自由基的氧化损伤、离子代谢的紊乱以及大脑的保护性抑制等方面[45-47]。基于疲劳的产生机制，可以从延缓疲劳的产生、促进疲劳的消除两方面考虑，采用药物手段、锻炼方法手段及营养的手段来达到抗疲劳的目的。其中，营养手段因安全、有效、无毒副作用而备受关注[48]。生物活性肽的抗疲劳功能是公认的，有研究报道，玉米肽、小麦肽、大豆小分子肽、海参肽、人参肽、蚕蛹蛋白多肽等均有抗疲劳作用[49-53]。贾靖霖等[54]通过小鼠负重游泳实验，发现核桃肽显著延长小鼠负重游泳力竭时间、降低血乳酸及尿素氮含量、升高肌糖原和肝糖原的储备。段心妍等研究发现，核桃肽干预SD大鼠可延长其力竭游泳的时间，加速肌肉中乳酸的代谢，减少血尿素氮的产生，提高血红蛋白的再生能力等。

2.5 核桃肽改善学习记忆活性研究

学习记忆的减退与神经细胞的凋亡、自由基损伤、学习记忆相关脑突触可塑性的改变、信使分子的浓度过高、中枢胆碱能神经递质的合成和释放减少等有关[55-57]。Hicyilmaz等[58]发现，核桃可以对认知功能的下降起保护作用，其机制主要涉及调节海马中的N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)和脂质过氧化水平。陈亮等[59]研究发现，核桃油可提高大鼠空间学习记忆能力，其机制可能与乙酰胆碱能系统有关。樊永波等[60]发现，精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸含量较高的核桃蛋白也是核桃增强学习记忆功能的有效成分。核桃肽富含谷氨酸及瓜氨酸，前者属于脑内信号传导有关的神经递质，后者是信使NO的前体物质，此外，核桃肽有较强的抗氧化活性，均对学习记忆有积极的改善作用。Li等[61]研究显示，核桃肽对东莨菪碱所致的学习记忆障碍有保护作用，并发现其机制与乙酰胆碱受体的显著增加有关。Zou等[62]发现，核桃肽可以通过调节抗氧化系统，减轻炎症反应，从而对阿尔茨海默症小鼠起到保护作用。

2.6 核桃肽对代谢紊乱性疾病的调节活性研究

代谢紊乱主要与营养物质的供需不平衡及吸收、消化、代谢障碍有关。研究表明，将核桃肽加入到酿酒酵母培养液可增加其对葡萄糖的利用，核桃肽干预STZ造模的2型糖尿病小鼠，可降低其血糖水平，且效果接近于二甲双胍，同时降低血清中的甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)水平，改善糖尿病发生发展过程中的糖脂代谢紊乱，改善心、肝、肾等脏器的病变[63]。核桃肽还有调节血脂代谢的活性。杨子明等[64]采用D-半乳糖建立小鼠亚急性衰老模型，测定小鼠血脂水平，结果表明，与衰老模型组小鼠比较，植物蛋白水解专用酶制得的核桃多肽组能够降低TC、TG、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量，碱性蛋白酶制得的核桃多肽组能够使高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量升高。此外，也有研究者发现，核桃肽还可以改善尿酸代谢的紊乱。该研究显示，胡桃粉水解物和脱酚核桃粕水解物能有效降低氧化钾致高尿酸血症大鼠的血尿酸水平，保护肾功能，并能抑制黄嘌呤氧化酶[65]。

2.7 核桃肽抗肿瘤活性研究

在癌症的发生发展过程中，膳食营养因素起着重要作用。近年来，随着功能性食品的研究发展，发现食品中的一些蛋白质成分具有抗癌功效，例如乳蛋白、螺旋藻蛋白、苦瓜蛋白、大豆蛋白等。研究发现，核桃仁蛋白木瓜酶水解物具有明显的抑制细胞生长作用(IC50值为1.62mg/mL)。核桃仁蛋白木瓜酶水解物对人结肠癌细胞(Caco-2)及人宫颈癌细胞(Hela)也具有明显的抑制生长作用(IC50值分别为2.04、2.21mg/mL)[66-68]。核桃肽对人乳腺癌细胞(MCF-7)也具有抑制作用。用木瓜蛋白酶制备核桃仁蛋白酶水解物，研究其对人乳腺癌细胞(MCF-7)增殖的影响，结果显示，水解物具有明显的抑制细胞生长作用，IC50值为1.62mg/mL，研究不同分子量范围的核桃肽组分对MCF-7细胞增殖影响的结果表明，MW<3k Da的低分子量组分具有较强的增殖抑制作用[69-70]。

2.8 核桃肽的其他生物活性作用

核桃仁蛋白酶水解物对大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用，且随着水解度的增加，酶解物的抑菌能力增强[71]；研究者以体外乙醇脱氨酶激活能力为指标，初步判断核桃活性肽可能具有解酒效果，通过对不同肽段氨基酸含量的测定，得出活性较高的5-10KDa肽段中的谷氨酸和丙氨酸略高于其他肽段，但无显著差异(P>0.05)[72]；酶作为生物体内最重要的功能组分之一，数量巨大，种类极多，用于调控各种生理活动，在整个生命活动中起着不可替代的作用。研究发现，核桃蛋白的酶解产物具有较明显的丝氨酸蛋白酶水解活性。核桃蛋白的胃蛋白酶酶解产物具有纤维蛋白原水解活性及一定的溶血活性，溶血率为47.49%，而胰蛋白酶酶解产物具有较强的溶血活性，溶血率高达199.33%[73]。◇