奶山羊USF1基因的克隆与组织表达分析

李 君，邓红雨 ，张景锋 ，侯霞飞，罗 军

（1.河南牧业经济学院动物科技学院，郑州市反刍动物营养重点实验室，郑州 450046；2.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100）

上游刺激因子（upstream stimulatory factor，USF）是一类具有典型的螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链（b-HLHLZ）结构的多功能转录因子，主要包括USF1和USF2两种亚型。USF对靶基因表达的调节作用主要是通过与靶基因启动子中的E-box结合而实现的，而E-box元件在真核细胞基因组中大量存在，所以USF是一类多功能转录因子。已有的研究表明，USF1参与调控细胞生长、糖脂代谢及排卵等生化过程［1-2］。USF1调控糖类和脂肪代谢基因的表达［3-4］，在鸡的小肠上皮细胞中，USF1调控糖类转运蛋白基因的表达［5］。在脂肪代谢过程中，它调控载脂蛋白基因、脂肪酸合成酶、乙酰COA羧化酶、激素敏感脂肪酶的表达［6-7］。因此，USF1基因在细胞糖类和脂类代谢过程中发挥着重要的调控作用。

乳腺组织是动物体内合成和分解脂肪的重要组织，泌乳期间乳腺脂肪的合成能力非常旺盛。研究奶山羊USF1基因可了解乳腺组织中脂质代谢的调控机理，从而可对提高山羊的生产性能以及改善山羊乳品质产生重要意义。目前，关于USF1在乳腺组织中的研究还鲜有报道。对于山羊USF1基因的序列大部分还只是预测，而且其表达规律还没有相关报道。

本研究旨在克隆奶山羊USF1基因编码区序列，并进行生物信息学分析；通过检测USF1基因在不同泌乳时期乳腺组织中的表达量，分析USF1在泌乳过程中的表达规律，为初步探讨USF1基因在奶山羊乳腺组织中的功能及对脂质代谢基因的调控作用提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验样品

试验动物来自西北农林科技大学萨能奶山羊原种场。样品采集的方法、流程和注意事项参考孙雨婷等［8］。选用体况良好、胎次相同、泌乳天数相近的奶山羊3只，分别采集泌乳前期（15 d）、盛期（60 d）、中期（120 d）和干奶期（331 d）的乳腺组织。用DEPC灭菌水反复清洗后，迅速放入已含有Trizol试剂的无RNase的离心管中，投入液氮中保存备用。

1.2 主要试剂

Trizol购自美国Invitrogen公司，DEPC购自美国Sigma公司；DNA分子标准、DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、pMD-19T载体、大肠杆菌（Escherichia coli）TOP 10感受态细胞均购自天根生化科技（北京）有限公司；T4DNA连接酶、DNA限制性内切酶、反转录试剂盒PrimeScriptRT Reagent Kit、LA Taq DNA聚合酶和实时定量试剂盒均购自宝生物工程大连有限公司（TaKaRa）。

1.3 引物设计

通过对 GenBank中牛（NM_001001161）、人（NM_007122）和猪（NM_001190245）等物种的USF1基因进行同源性比对，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6软件在保守区域设计特异性克隆引物，上游引物序列：5’-GACCAGTTCCTCGGATGTGC-3’；下游引物序列：5’-TGTGGCTCCTGGGCTATCTG-3’，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 RNA提取与cDNA的合成

采用Trizol一步法提取羊乳腺组织总RNA，具体操作步骤见文献［9-10］。按照 Takara公司PrimeScriptRT reagent Kit说明书操作，将检测合格的RNA反转录成cDNA。

1.5 山羊USF1基因的克隆与测序

对USF1基因CDS区进行PCR扩增，反应条件：95℃预变性 4 min；94℃变性 30 s，64℃退火 30 s，72℃延伸1 min，进行34个循环；最后72℃再延伸10 min，4℃保存。反应结束后，用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。将检测正确的目的片段进行琼脂糖凝胶回收，PCR回收产物与pMD19-T载体连接，连接产物转化Top10感受态细胞。37℃培养箱中培养12～16 h，进行蓝白斑筛选，挑取多个白色菌落扩繁提取质粒，经酶切鉴定为阳性的质粒进行测序。

1.6 奶山羊USF1基因的生物信息学分析

奶山羊USF1与不同物种间序列比对方法及蛋白质结构预测参照文献［11］。利用NCBI中的Blastn和Blastp（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）分析奶山羊 USF1基因核苷酸及其编码的氨基酸序列与牛、小鼠和人的差异；通过BioXM2.6软件对USF1的氨基酸序列进行物种间多重比对；利用 ProtParam（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）预测奶山羊USF1蛋白质的分子量和理论等电点。通过TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、ExPASy 中的 ProtScale 程序（http：//us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）、Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）分别对USF1进行跨膜结构、蛋白质疏水性和蛋白质三级结构预测分析。利用 cNLS Mapper（http：//nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgibin/NLS_Mapper_form.cgi）对USF1的核定位信号分析预测。

1.7 奶山羊USF1基因的组织表达分析

以GAPDH、UXT为内参基因，每个模板设置3个加样重复，采用 2-△△Ct法进行表达数据的结果分析［12］。基因实时定量引物如表1。

1.8 数据统计分析

数据以平均值±标准误表示，利用SPSS 22.0进行方差分析，P＜0.05为差异显著。

表1 实时定量PCR引物序列

2 结果与分析

2.1 奶山羊USF1基因的克隆与测序

从奶山羊乳腺组织中扩增得到大小约1 000 bp的片段。测序结果表明，山羊USF1基因序列1 030 bp。分析发现，该基因编码区序列为933 bp，编码310个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。提交到GenBank，登录号为 MF953285。

2.2 奶山羊USF1基因的序列分析

由图1可知，奶山羊USF1基因CDS区核苷酸序列与GenBank中牛、猪和人等物种的USF1基因的相似性分别为98%、95%、94%；编码氨基酸序列的相似性为99%。

图1 奶山羊与牛、猪、人USF1序列的氨基酸序列比对结果

USF1的蛋白质分子量为33.497 kD，理论等电点为5.36。生物信息学在线软件预测结果表明，USF1不存在跨膜结构；其疏水性最大值1.5，最小值-3.367，分别位于第35 aa和第197 aa处。奶山羊USF1蛋白质三级结构具有典型的螺旋-环-螺旋结构；亚细胞定位预测结果表明，该蛋白定位在细胞核内，USF1的核定位信号（RDEKRRAQH）存在于氨基酸序列内部，在USF1的196位aa处，且这部分氨基酸位于USF1的DNA结合域内。

2.3 奶山羊USF1基因不同泌乳时期乳腺组织的表达分析

以GAPDH和UXT为内参基因，通过实时荧光定量PCR技术检测奶山羊USF1基因在不同泌乳时期（泌乳前期、盛期、中期）和干奶期乳腺组织的mRNA表达量。结果表明，USF1基因在不同泌乳期的mRNA表达量均显著高于干奶期（P＜0.05），其中USF1在泌乳中期的表达量又显著高于泌乳初期（P＜0.05）和盛期（P＜0.05）（图2）。

图2 奶山羊不同泌乳时期乳腺组织USF1基因的mRNA表达

3 讨论

USF1是一种属于碱性-螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链（b-HLH-LZ）家族的转录因子，它以二聚体形式在细胞核中与靶基因启动子上的E-box（核心序列为5'CACGTG3'）特异性结合，发挥其转录调控作用［13］。前人的研究表明，USF1参与调控脂质代谢。为了进一步研究奶山羊乳腺脂肪酸合成过程中是否有USF1参与，本研究克隆了奶山羊USF1基因编码区序列，对其进行生物信息学分析，并通过实时荧光定量PCR方法研究其在山羊不同泌乳阶段乳腺组织中的表达变化情况。

3.1 奶山羊USF1基因的克隆

USF最早是从Hela细胞核提取物中部分纯化出的一种序列特异性转录因子。研究发现，USF可以使腺病毒晚期启动子的转录活性增强10～20倍，故亦称晚期转录因子。USF有2个变异体：USF1和USF2，均隶属于b-HLH-LZ转录因子家族，但分别由不同的基因转录。人的USF1基因定位于chr1q22～q23，总长4 kb，共有10个外显子，编码310氨基酸残基，USF2基因定位于chr19q23，全长10 kb，也含有10个外显子，编码346氨基酸残基，而鼠类动物的USF2则是在chr7上［14-15］。猪的USF1基因包含11个外显子和10个内含子［16］。除完整的USF1外，目前在小鼠中还发现USF1的2种由于选择性剪接而来的变体，它们分别编码USF1的244个和49个氨基酸残基，其功能尚不清楚。本研究克隆的奶山羊USF1编码区序列933 bp，编码310个氨基酸残基，为完整的USF1编码区序列，至于山羊USF1是否含有其他变体还不清楚。

3.2 奶山羊USF1基因的结构分析

在真核生物中，USF广泛表达且十分保守。人和鼠类动物USF1基因的编码区中有91%的相似性，相应蛋白质中相似性达98%［17］；本研究中山羊USF1基因编码区核苷酸序列与牛、猪和人等物种的USF1基因的相似性分别为98%、95%、94%；编码氨基酸序列的相似性为99%；编码区的高度保守性证实了所分离基因的正确性。前人研究表明，USF1和USF2在C端都具有b-HLH-LZ结构域，其中，碱性区（BR）由外显子8编码，它与亮氨酸拉链（LZ）结构域共同介导USF与靶DNA的结合，螺旋-环-螺旋（HLH）则介导 USF 的二聚化［13-14］。蛋白质三级结构预测发现，奶山羊USF1具有典型的b-HLH-LZ结构，与文献报道一致，该区域在进化中十分保守，提示该结构具有重要的生物学功能。USF1与启动子中含有E-box基序的靶基因结合发挥转录调控作用，表明该基因主要在细胞核中发挥作用。人的USF1基因C端具有核定位信号（NLS），定位于细胞核中。本研究中，经预测发现，奶山羊USF1蛋白定位在细胞核内，其核定位信号（RDEKRRAQH）存在于氨基酸序列内部，且这部分氨基酸位于USF1的DNA结合域内，与文献报道一致。

3.3 奶山羊USF1基因的组织表达与糖脂代谢

USF1可以和自身及其他USF蛋白形成同源或异源的二聚体，结合在靶基因启动子的E-box元件上而发挥转录调控作用［18-19］。研究证实，USF1是负责血脂血糖自身平衡的调节基因。多数研究表明，USF1在真核细胞内普遍存在，它和细胞生长以及糖脂代谢等生理过程密切相关［20-22］。USF1广泛参与调控糖脂代谢相关基因的表达［23］。现已有研究表明，载脂蛋白 A5 基因（APOA5）在降低血浆甘油三酯水平上具有极其重要的作用，其作用机制为USF能结合到APOA启动子区的E-box上，进而增强APOA5基因的转录表达［4］。泌乳是奶山羊的主要生理特点，而乳腺组织又是泌乳时期脂质代谢最为旺盛的组织之一，因此在研究USF1在泌乳过程中的作用之前，本研究检测了USF1在奶山羊乳腺不同泌乳阶段的组织表达情况，发现其在整个泌乳周期中上调表达，在泌乳期前期、盛期、中期的表达量显著高于干乳期（P＜0.05），该结果预示了USF1可能在奶山羊泌乳过程中发挥着一定的生理功能，暗示USF1参与山羊乳腺泌乳过程中乳脂乳糖代谢的调控。

4 结论

本研究首次克隆了奶山羊USF1基因，并对其在不同泌乳时期的乳腺组织中的表达情况进行了分析。结果表明，USF1在泌乳期的表达量显著高于干奶期（P＜0.05），且在泌乳中期表达量显著高于泌乳前期（P＜0.05）和盛期（P＜0.05）。研究结果为转录因子USF1在奶山羊乳腺中的功能及对乳脂乳糖合成的调控机理奠定了基础。

［1］Putt W，Palmen J，Nicaud V，et al.Variation in USF1 shows haplotype effects，gene：gene and gene：environment associations with glucose and lipid parameters in the European Atherosclerosis Research Study II［J］.Human Molecular Genetics，2004，13：1587-1597.

［2］Datta T K，Rajput S K，Wee G，et al.Requirement of the transcription factor USF1 in bovine oocyte and early embryonic development［J］.Reproduction，2015，149（2）：203-212.

［3］Sanchez A P，Zhao J，You Y，et al.Role of the USF1 transcription factor in diabetic kidney disease ［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2011，301（2）：271-279.

［4］Prieur X，Huby T，Coste H，et al.Thyroid hormone regulates the hypotriglyceridemic gene APOA5［J］.Journal of Biological Chemistry，2005，280，：27533-27543.

［5］张利环，李玲香，张瑜，等.转录因子USF1调控鸡小肠上皮细胞中糖类转运蛋白表达［J］.畜牧兽医学报，2015，46（10）：1713-1720.

［6］Smih F，Rouet P，Lucas S，et al.Transcriptional regulation of adipocyte hormone-sensitive lipase by glucose［J］.Diabetes，2002，51：293-300.

［7］Travers M，Vallance A，Gourlay H，et al.Promoter I of the ovine acetyl-CoA carboxylase-α gene：an E-box motif at-114 in the proximal promoter binds upstream stimulatory factor （USF）-1 and USF-2 and acts as an insulin-response sequence in differentiating adipocytes［J］.Biochem J，2001，359：273-284.

［8］孙雨婷，罗军，邱思源，等.奶山羊短链脂肪酸受体基因（GPR43）编码区（CDS）的克隆及表达分析［J］.农业生物技术学报，2014，22（7）：876-882.

［9］滕炎玲，罗军，李君，等.西农萨能奶山羊甘油三酯水解酶基因（ATGL）的cDNA克隆与组织表达分析［J］.农业生物技术学报，2010，18（6）：1134-1142.

［10］孙雨婷，罗军，朱江江.奶山羊短链脂肪酸受体GPR41基因的克隆及组织表达分析［J］.畜牧兽医学报，2012，43（2）：319-323.

［11］李君，罗军，胡仕良.山羊Ets-1基因cDNA的克隆与序列分析［J］.中国草食动物，2011，31（6）：5-8.

［12］Livak K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using Real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod ［J］.Methods，2001，25（4）：402-408.

［13］Ferre-D'Amare A，Pognonec P，Roeder R.Structure and function of the b/HLH/Z domain of USF［J］.The EMBO Journal，1994，13：180.

［14］Sirito M，WalkerS，LinQ.Members of the USF family of helix-loop-helix proteins bind DNA as homo-as well as heterodimers［J］.Gene Expression，1991，2：231-240.

［15］Shieh B H，Sparkes R S，Gaynor R B，et al.Localization of the gene encoding upstream stimulatory factor（USF） to human chromosome 1q22-q23［J］.Genomics，1993，16（1）：266-268.

［16］乔木，武华玉，黄京书，等.猪USF1基因克隆与序列分析［J］.湖北农业科学，2013，52（24）：6175-6181.

［17］汪大为.上游刺激因子进化的研究［D］.大连：辽宁师范大学，2008.

［18］Pirkka-Pekka L，Jarkko S，Sander K.et al.USF1 deficiency activates brown adipose tissue and improves cardiometabolic health ［J］.Sci Transl Med，2016，8（323）：1-19.

［19］Zeng Y，Li H，Zhang X，et al.Basal transcription of APOBEC3G is regulated byUSF1gene in hepatocyte ［J］.Biochem Bicphys Res Commun，2016，470（1）：54-60.

［20］Chen B，Chen X P，Wu M S，et al.Expressions of heparanase and upstream stimulatory factor in hepatocellular carcinoma ［J］.Eur J Med Res，2014，19（1）：45-53.

［21］Fan Y M，Hernesniemi J，Oksala N，et al.Upstream transcription factor 1（USF1）allelic variants regulate lipoprotein metabolism in women and USF1 expression in atherosclerotic plaque［J］.Sci Rep，2014（4）：4650-4658.

［22］Yamanaka T，Tosaki A，Kurosawa M，et al.Genome-wide analyses in neuronal cells reveal that upstream transcription factors regulate lysosomal gene expression［J］.FEBS J，2016，283（6）：1077-1087.

［23］Matsuda M，Tamura K，Wakui H，et al.Upstream stimulatory factors 1 and 2 mediate the transcription of angiotensin II binding and inhibitory protein［J］.J Biol Chem，2013，288（26）：19238-19249.