GC-MS/MS测定不同食品中氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯的含量

周佳，成长玉，郭庆，陈祥贵

（1.四川省食品药品检验检测院，四川成都 611731；2.西华大学食品与生物工程学院，四川成都610039）

氨基甲酸甲酯（Methy Carbamate，MC）及氨基甲酸乙酯（Ehthy Carbamate，EC）是在食品发酵过程中产生的一种发酵副产物，广泛存在于发酵食品和酒精饮料中[1-3]。早在上世纪六七十年代，就已经证实两种化合物均能诱发良性或恶性肿瘤，特别是肺癌和肝癌[4]，到近二十年有可信数据显示，其在一般食品中含量较低，而发酵食品中含量较高。国际癌症研究机构（International Agency for Research on cancer，IARC）已将氨基甲酸乙酯认定为2A级致癌物[5]，鉴于其对人类具有潜在的致癌性，氨基甲酸乙酯含量已成为近年来国际社会高度关注的食品安全热点问题之一。特别是随着居民生活水平提高，对发酵食品消费量不断增加，氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯对健康可能存在一定安全隐患。现行国家食品标准GB 5009.223-2014《食品安全国家标准食品中氨基甲酸乙酯的测定》[6]中对氨基甲酸乙酯含量测定的方法，只适用于液体基质，没有对固体基质的测定方法，并且方法采用GC-MS的选择离子监测模式（Selected Ion Monitoring，SIM），干扰很大，腐乳、豆豉等复杂基质用GC-MS（SIM模式）常常无法定性。另一方面，氨基甲酸甲酯的测定在行业检验标准中是一片空白，查阅文献，虽然被广泛承认其对人体的危害性，但现阶段只看到少量报道用液相或气相-质谱（SIM模式）测定白酒中的氨基甲酸甲酯[7-8]，对其他发酵食品中氨基甲酸甲酯含量测定方法则未见报道。我国目前还未明确MC及EC在食品中的限量，制定稳定的检测方法很有必要，方便了解我国发酵食品中MC及EC的含量水平，为制定相应的限量提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

腐乳、豆豉、发酵乳、料酒、酱油、醋、白酒：市售。

1.2 主要仪器

Agilent 7890A/7000b GC-MS/MS三重四级杆气相色谱串联质谱仪：安捷伦科技有限公司；Sartorius CPA225D电子天平；德国赛多利斯茵泰科公司；Milli-Q超纯水仪；美国Millipore公司；AS10200A型超声波清洗器：昆山超声仪器有限公司。

1.3 试剂

甲醇：Merck公司；乙酸乙酯、乙醚、正己烷、氯化钠：成都市科隆化工试剂厂；硅藻土固相萃取柱（1 000 mg/6 mL及2 000 mg/12 mL）：天津博纳艾科技有限公司。

1.4 标准品

氨基甲酸乙酯：Dr.Ehrenstorfer GmbH；氨基甲酸甲酯：北京百灵威科技有限公司；D5-氨基甲酸乙酯：CDN ISOTOPES。

2 方法

2.1 标准中间液的配制

2.1.1 目标物使用液的配制

精密称定氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯对照品适量，分别置棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至各量瓶中，得单一对照品储备液。精密量取氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯储备液适量，用甲醇配制成混合对照品中间液。（氨基甲酸甲酯浓度为2.0 μg/mL、氨基甲酸乙酯浓度为 1.0 μg/mL）。

2.1.2 内标使用液的配制

精密称定D5-氨基甲酸乙酯对照品适量，置棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容置容量瓶中，得内标储备液。精密量取D5-氨基甲酸乙酯内标储备液适量，用甲醇配制成约2 μg/mL内标中间液。

2.1.3 基质空白标准溶液

将经过测定不含有被测目标物的同基质物质作为空白样品，照样品前处理项下（不加内标使用液）制备空白样品基质溶液。精密吸取适量混合对照品中间液，各加入内标中间液100 μL，40℃以下氮吹至近干，加入空白样品基质溶液各1 mL，制成基质标准使用液。

2.2 样品前处理

2.2.1 液体基质

液体基质（包括料酒、酱油、醋、白酒）样品摇匀，称取 1 g（精确至 0.001 g）样品，加入 100 μL 内标中间液（约 2 μg/mL），加入氯化钠 0.3 g（酱油可不加），涡旋混匀，超声5 min，使溶解，混匀，将样品全部转移至SPE小柱（Agela cleanert SLE-SPE，1 000 mg/6 mL）上，静置10 min，用10 mL正己烷淋洗后，用10 mL乙醚-乙酸乙酯（95∶5）洗脱，收集洗脱液，洗脱液40℃以下氮吹至近干，用甲醇定容至1 mL，制成供试液。

2.2.2 固体基质

固体及半固体基质（腐乳、豆豉、发酵乳）样品混匀（腐乳需用研钵研成糊状），称取5 g（精确至0.001 g）样品，加入 500 μL 内标中间液（约 2 μg/mL）、氯化钠1.0 g，精密加入超纯水10 mL，涡旋混匀，超声20 min，使充分混匀，离心，滤过，精密量取滤液2 mL至SPE（Agela cleanert SLE-SPE，2 000 mg/12 mL）上，静置10 min，用20 mL正己烷淋洗后，用20 mL乙醚-乙酸乙酯（95∶5，体积比）洗脱，收集洗脱液40℃以下氮吹至近干，用甲醇定容至1 mL，制成供试液。

2.3 色谱质谱条件

2.3.1 色谱条件

色谱柱：毛细管色谱柱，DB-INNOWAX，30 m×0.25 mm（内径）×0.25 μm（膜厚）；进样口温度：220℃；进样方式：脉冲不分流；进样量：1 μL；柱温：80 ℃保持2 min，以10℃/min至180℃保持3 min，240℃后运行6 min；流速 1.0 mL/min。

2.3.2 质谱条件

载气：氦气；碰撞气：氮气；离子源：电子轰击离子源（EI）；电子能量：70 eV，四级杆温度：150℃；离子源温度：230℃；检测方式：多反应监测（MRM）方式；溶剂延迟：6.5 min。检测化合物离子参数见表1，对照品及样品（腐乳）总离子流图见图1，各化合物提取离子流图见图2。

表1 检测化合物离子参数Table 1 Ion parameters of target compound

图1 氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯对照品及样品（腐乳）总离子图Fig.1 Total ion chromatograms of methyl carbamate and ethyl carbamate

图2 各化合物提取离子流图Fig.2 Ion flow diagrams of various compounds

2.4 线性关系及检测下限考察

取“2.1”项下混合对照品中间液适量，用甲醇稀释成系列混合对照品溶液（每个化合物至少测定5个浓度水平），照上述方法进行测定，记录峰面积，以对照品浓度（ng/mL）为横坐标，以相应的峰面积为纵坐标，进行线性回归，计算回归方程。同时以信噪比（S/N）为3∶1及10∶1为基准分别测定各化合物的检出限及定量限，结果见表2。

表2 MC及EC的回归方程、线性范围、检出限、定量限Table 2 Regression equaion，linear ranges，limit of detection and limit of quantitation of the determination method for methyl carbamate and ethyl carbamate

结果表明各化合物在浓度范围内线性关系良好，氨基甲酸甲酯检出限在6 ng/mL，线性范围为20 ng/mL～1 000 ng/mL，氨基甲酸乙酯检出限在3ng/mL，线性范围为 10 ng/mL～500 ng/mL。

2.5 稳定性试验

取“2.2”项下制备的供试品溶液，室温放置，分别在0、2、4、8、12、48h进样测定，记录其峰面积。结果各时间段氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯峰面积的RSD%分别为3.01%、0.57%，表明供试品在48 h内稳定。

2.6 加标回收试验

2.6.1 液体基质加标回收试验

精密称取已测定含量的样品（共9份，分别精密加入低、中、高3个水平的混合对照品中间液，每份浓度3份），加入内标中间液 100 μL，按“2.2.1”项下制备加标回收率测定样品溶液，进样测定，内标法计算各化合物的平均回收率，结果见表3。

表3 MC及EC在液体基质中（料酒）的加标回收试验结果（n=3）Table 3 The results of recovery experiment for methyl carbamate and ethyl carbamate in fluid matrix（n=3）

氨基甲酸甲酯回收率在75.83%～80.31%，RSD%小于3.04%，氨基甲酸乙酯回收率在99.80%～100.52%，RSD%小于2.03%，表明准确度良好。

2.6.2 固体基质加标回收试验

精密称取用研钵研成糊状的样品（腐乳共9份，分别精密加入低、中、高3个水平的混合对照品溶液，每份浓度 3 份），加入内标中间液 500 μL，按“2.2.2”项下制备加标回收率测定样品溶液，进样测定，内标法计算各化合物的平均回收率，结果见表4。

表4 MC及EC在固体半固体基质中（腐乳）的加标回收试验结果（n=3）Table 4 The results of recovery experiment for methyl carbamate and ethyl carbamate in solid and semisolid matrix（n=3）

氨基甲酸甲酯回收率在60.28%～65.72%，RSD%小于3.22%，氨基甲酸乙酯回收率在99.86%～101.34%，RSD%小于2.44%，表明准确度良好。

2.7 各类食品中氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯含量

取各样品（液体基质约1.0 g，固体基质约5.0 g），精密称定，液体基质按“2.2.1”项下供试品溶液方法制备，固体基质按“2.2.2”项下供试品溶液方法制备，进样测定，以D5-氨基甲酸乙酯为内标计算含量，结果见表5。

表5 各类发酵食物中氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯含量Table 5 The content of methyl carbamate and ethyl carbamate in various types of fermented food

3 结论

1）现行国家标准中只有针对液体基质中氨基甲酸乙酯的测定方法，没有针对如腐乳、豆豉、酸奶这种固体及半固体基质的方法，本文建立了固体及半固体基质的前处理方法。

2）氨基甲酸甲酯（MC）及氨基甲酸乙酯（EC）均属于微量检测，由于其分子量均较小（MC：75；EC：89），碎片离子易被干扰，文献报道中测定氨基甲酸乙酯方法多使用GC-MS（SIM模式），单四级杆气质联用法[9-10]，常常无法定性，复杂的基质（如腐乳、豆豉）表现得尤为突出，腐乳中氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯干扰图见图3、图4；本法采用GC-MS/MS（MRM模式）可以有效减少杂质的干扰，提高灵敏度。

图3 腐乳基质中氨基甲酸甲酯SIM模式及MRM模式对比图Fig.3 The comparison chart of SIM mode with MRM mode used determing methyl carbamate in fermented bean curd

图4 腐乳基质中氨基甲酸乙酯SIM模式及MRM模式对比图Fig.4 The comparison chart of SIM mode with MRM mode used determing ethyl carbamate in fermented bean curd

3）氨基甲酸乙酯（EC）为多位点致癌物，其危害性已得到国内外广泛关注，其相关文献报告较多，氨基甲酸甲酯（MC）与氨基甲酸乙酯（EC）一样，同为食品发酵副产物，现今鲜少被报告，发酵食品中MC残留的多少，尚待进一步调查和分析，本文首次建立GC-MS/MS内标法测定不同基质中同时测定氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯含量的方法，对关注食品安全与人体健康有极其重要的意义。

4）此方法关键步骤是收集洗脱液后氮吹，考察样品分别用 20、30、40、50、60 ℃氮吹，结果发现在 40 ℃以下氮吹峰面积较稳定（见图5）；虽然本文采用内标法，峰面积有一定损失也可以对含量进行校正，但若样品含量较低时，氮吹温度过高，样品将检测不到含量，影响较大，综合考虑以后选择40℃以下氮吹。

图5 氮吹温度考察Fig.5 Investigation of the nitrogen blowing temperation

5）洗脱液含95%的乙醚，很容易便被吹干，如若吹干，将测量不到样品中氨基甲酸乙酯及氨基甲酸甲酯的含量，因此，此试验切忌不能将样品吹干，否则无法检测到样品中氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯的含量。

[1]张庄英.白酒蒸馏和贮存过程中氨基甲酸乙酯的研究[D].无锡:江南大学,2014

[2]Wu PG,Ma BJ,Wang LY,et al.Detection of methyl cabamate and ethyl carbamate in wine by gas chromatographymass spectrometry[J].Chinese journal of preventive medicine,2013,47(11):1056-1057

[3]詹沛鑫.发酵制品中氨基甲酸甲酯与乙酯的色谱测定法[J].发酵科技通讯,1994,23(4):25

[4]PARK S K,KIM C T,LEE J W.Analysis of ethyl carbamate inKorean soy sauce using high-performance liquid chromatography withfluorescence detection or tandem mass spectrometry and gas chromatographywith mass spectrometry[J].Food Control,2007,18(8):975-982

[5]SAKANO K,OIKAWA S,HIRAKU Y,et al.Metabolism of carcinogenicurethane to nitric oxide is involved in oxidative DNA damage[J].Free Radical Biol Med,2002,33(5):703-714

[6]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 5009.223-2014食品中氨基甲酸乙酯的测定[S].北京:中国标准出版社,2014

[7]袁东,李艳清,付大友.高效液相色谱-质谱法测定白酒中的氨基甲酸甲酯[J].酿酒科技,2007,154(4):121-123

[8]谭文渊,袁东,付大友,等.气相色谱-质谱联用测定白酒中的氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯[J].食品科学,2011,32(16):305-507

[9]张万利,梁新红,冉军舰,等.SLE结合GC-MS法测定葡萄酒中氨基甲酸乙酯[J].中国酿造,2017,36(1):176-179

[10]赵艳菊,施敬文.气相色谱质谱内标法测定发酵乳制品中的氨基甲酸乙酯[J].食品与发酵科技,2017,53(1):92-94