Eph受体家族在肺癌中的研究进展及作为肺癌治疗靶点的可能

何佳雯 综述 陈公琰 审校

全世界每年约一百多万人死于肺癌，占所有恶性肿瘤相关性死亡的第1位[1]。在我国，肺癌也是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[2]。根据组织学可将肺癌分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。非小细胞肺癌进一步可分为三种主要的亚型：腺癌、鳞状细胞肺癌和大细胞肺癌[3]。尽管近年来许多其他类型癌症的生存率有所提高，肺癌的5年生存率仍然相对较差，主要是由于肺癌患者的早期症状不典型，确诊时已为晚期，因此，早期诊疗手段的发展对于肺癌患者的治疗以及预后显得尤为重要。

促红细胞生成素产生肝细胞受体(Erythropoietin-producing hepatocellular receptor，Eph)及其配体 Ephrin，作为受体酪氨酸激酶(RTK)中最大的家族，在肺癌中的作用和对癌症的治疗潜力受到人们越来越多的关注。Eph家族由至少15个受体和9个配体组成。根据序列同源性和结合配体的不同分为两类：A类和B类，A类Eph受体同糖基磷酸化肌醇(GPI)锚定的EphrinA结合，而B类Eph受体同跨膜蛋白EphrinB结合[4-5]。Eph受体是一种膜结合型I型糖蛋白，由N-末端糖基化配体结合区、跨膜区和胞内具有酪氨酸激酶活性区域构成。A类Ephin配体(Ephrin A1-A5)通过GPI连接质膜的外层。B类Ephrin配体(Ephrin B1-B3)为跨膜蛋白，高度保守的胞质尾区为一个具有PDZ结构域的结合基序。Eph受体和Ephrin配体的结构共同决定了他们相互作用的特异性和下游信号转导通路。Eph受体同Ephrin配体相结合后为双向信号，这种特异性使后续的信号处理更为复杂，也有助于在不同生理和病理状态下Eph-Ephrin信号的精细调控[6]。

本文将阐述肺癌中Eph受体及Ephrins的研究，包括他们的表达，在肺癌发生发展中的作用及其机制以及作为靶向治疗靶点的潜能。

1 Eph受体家族在肺癌中的表达

Eph受体家族及配体Eprins在肺癌组织中广泛表达[7-10]。其中EphA2在肺癌、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌中均有高表达[11]。Brannan等[12]研究表明，非小细胞肺癌患者EphA2高表达相比低表达有较差的无进展生存期，而且是非小细胞肺癌患者复发时间和转移时间的一个独立的预后因素，表明EphA2可作为肺癌的预后指标。EphA2的表达也同患者的吸烟史呈正相关。此外研究表明EphA2是RAS和EGFR在其他种癌症中的靶基因[12-13]，K-ras基因突变的非小细胞肺癌患者中EphA2的表达增加，与EGFR的活性呈正相关，而与EGFR突变无相关性[14]。

EphA3在肺癌细胞中突变最为常见，因此也被视为肺癌潜在的驱动因素。Lisabeth等[15]人构建了28 个EphA3的突变体，系统的研究了其对EphA3功能的影响。许多EphA3的突变体损伤了激酶活性、同Ephrin配体结合力、降低EphA3的细胞表面定位的水平，这表明体细胞的突变可能破坏了EphA3 配体和激酶依赖的肿瘤抑制功能。 虽然Eph受体及Ephrins配体在肺癌中有显著的异常表达，但其功能失调的机制尚未明确。

2 Ephs/Ephrins在肺癌中的作用与相关机制

Eph及Ephrins广泛参与肺癌的各种生理活动，包括血管的发生、组织边界的形成、细胞迁移、轴突导向和突触可塑性[16]。

2.1 对细胞生长及生存的影响

EphA2在肺癌中的过表达和它作为肺癌的独立预后因素表明了其致癌作用。Faoro等在H2170鳞状细胞癌细胞株和2/28例的鳞状细胞癌患者的样本中检测到了EphA2的G391R突变。随后，他们发现WT和G391R突变的 EphA2可增进BEAS-2B细胞不依赖支持物生长，表明其较高的致癌可能。而且EphA2 WT或EphA2 G391R都可以激活mTOR及其下游的p70 S6激酶，而G391R相比其对照组野生型对mTOR通路激活作用更强。mTOR和p70 S6激酶的活化可以调节细胞的存活，这也解释了EphA2 WT和EphA2 G391R过表达细胞生存率的提升[11]。关于EphA2的另一研究显示，EphA2 人工可溶性配体 EphrinA1-Fc降低恶性间皮瘤细胞中EphA2的表达，并抑制丝裂霉素(MMC)的增殖。转染EphrinA1的 MMC抑制3D基质胶中肿瘤组织的生长[17]。体外实验中EphrinA1结合微球蛋白能有效抑制非小细胞肺癌肿瘤团在基质胶中的生长[18]。

在EphB亚家族中，EphB3在非小细胞肺癌临床标本和细胞系中的表达明显上调。Ji等[19]通过控制非小细胞肺癌细胞中EphB3的水平，表明EphB3同细胞生长生存相关，亦影响细胞能动性，在非小细胞肺癌细胞系中过表达的EphB3通过激酶依赖的方式加速了细胞在体内和体外的生长，沉默EphB3则抑制肿瘤的生长和转移。此外，TRAF2作为TNF家族成员的信号传导因子，同EphB3相互作用，激活Caspase-8诱导细胞凋亡，进而从另一方面调节细胞生存。

2.2 与转移的关系

Eph及Ephrins在神经系统的发育中被认为是触发排斥和吸引信号的导向分子，从而在微环境中直接引导细胞运动。它们也密切参与调控细胞骨架重排，是转移过程的理想调控者。研究表明，EphB3在非小细胞肺癌组织中的表达比正常匹配组织中多，而且EphB3的表达水平与患者的临床特征，如肿瘤大小、分化和转移相关。过表达的EphB3通过激酶依赖的方式刺激非小细胞肺癌的细胞迁移，而降低EphB3会导致其黏着数增加，并抑制细胞的迁移以及在体内的转移[19]。进一步研究发现尽管EphB3在非小细胞肺癌中过表达，但它的同源配体EphrinB1或EphrinB2表达明显下调，受体的酪氨酸磷酸化也相应减少。过表达EphB3的非小细胞肺癌细胞中，活化的EphB3抑制体外的细胞迁移和体内的转移，因此，EphB3磷酸化的低水平是非小细胞肺癌细胞转移所需的条件[20]。

Eph受体对肿瘤转移不仅仅是促进作用，还包括例如下调的EphB4降低了乳腺癌细胞的生存率、增殖以及迁移和侵袭[21]；EphrinB2活化的EphB4抑制细胞的增殖、运动、侵袭和体内肿瘤的形成[22]。EphrinA1激活的 EphA2抑制神经胶质瘤和前列腺癌细胞的趋化迁移，而EphA2高表达通过一种配体依赖的方式促进细胞迁移[23]。这种矛盾可以归因于Eph-Ephrin信号双向调节的独特性。Eph受体的激酶依赖性和非依赖性下游信号通路造成了Eph受体介导的信号转导的复杂性，从而造成对细胞转移的双向影响。

2.3 血管生成中的作用

Eph及Ephrins参与血管生成的关键步骤，包括旁分泌细胞之间接触、细胞外基质的黏附和细胞迁移。越来越多的研究表明Ephs 及其配体在肿瘤血管生成中起重要作用。Favre等[23]检测了参与成人肺内皮细胞血管发育和血管生成相关基因的表达，他们发现Eph家族中的众多成员，例如EphrinA1、EphrinB1、EphrinB2和EphB4都参与血管的发生发展。

在促血管生成因子的刺激下，血管内皮细胞中的血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)能够诱导EphrinB2表达上调，而对 EphB4 的表达无明显影响，其作用机制可能是通过 Notch 信号转导通路实现的[24]。此外，Notch信号通路Delta样配体4抗体(DLL4)作为Notch配体之一，对血管发育有着重要作用。封锁DLL4通过非生产性血管的生成来增加血管密度和减少组织灌注，从而抑制NSCLC的生长。Yamanda等发现了封锁DLL4能让VEGF-DLL4-Ephrinb2级联信号反应参与非生产型血管生成，表明EphrinB2/EphB信号在非小细胞肺癌非生产性血管生成中起到重要作用[25]。肺癌中Eph受体家族对血管生成的作用研究较少，但在乳腺癌、胃癌、胰腺癌等肿瘤中的研究可以为其提供有力依据。

2.4 参与肿瘤的耐药

肺癌患者即使早期确诊及治疗，五年生存率仍较低，其中一个主要原因是肺癌细胞耐药的产生，尤其是多药耐药(MDR)。因此，如何克服多药耐药是肺癌治疗中的难题之一。在多药耐药相关的研究中发现，miRNA的异常可导致肺癌耐药[27]。NCI-H69AR是小细胞肺癌的一个多药耐药细胞株，相比母株NCI-H69其EphA3的表达显著降低，沉默EphA3表达可显著增加SCLC细胞对化疗药物ADM、DDP、CP-16的耐药性，能够提升药物作用后的细胞生存率，升高IC50值；上调EphA3表达结果则正相反。研究发现EphA3通过PI3K/BMX/STAT3信号通路调节SCLC的多药耐药。miRNA靶基因分析显示，EphA3 3′-UTR与miR-7具有互补结合位点，提示miR-7对EphA3可能有靶向调节作用。上调和下调miR-7的表达水平，可导致SCLC细胞中EphA3的表达降低或升高，以及细胞耐药性、生存率和IC50的一系列变化，且miR-7亦通过PI3K/BMX/STAT3信号通路调节SCLC的耐药性，Spearman相关分析显示，miR-7和EphA3的表达呈负相关，过表达或沉默EphA3能降低或增加miR-7的表达，表明两者之间具有双向调控作用，共同参与SCLC的耐药性调节[28]。髓系白血病及多发性骨髓瘤中Eph受体介导的耐药的研究取得了一定进展，可以为肺癌的研究提供理论依据[29-30]。

3 Ephs/Ephrins在肺癌中靶向治疗的可能

继表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂使有EGFR突变的肺癌患者获益后，研究人员的注意力集中在其他酪氨酸激酶受体作为肺癌的潜在药物靶点的可能。

EphA2在肺癌中的高表达及其显著的预后价值，使它成为Eph家族中最受关注的一个受体。EphrinA1已经被证实能够抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，其归结于EphA2表达的下调，Lee等研究了EphrinA1偶联白蛋白微球(MS)对体外NSCLC的生长和迁移的影响。他们发现EphrinA1 偶联白蛋白微球对非小细胞肺癌细胞的迁移和基质胶中集落的生长有明显抑制作用，却只有极微的毒性作用，说明EphA2可能成为非小细胞肺癌靶向治疗的靶点之一[18]。达沙替尼是一种口服的BCR/ABL和Src家族双重激酶抑制剂，用于治疗慢性粒细胞白血病患者。有研究表明EphA2在达沙替尼敏感的细胞系中呈高表达，且达沙替尼可以抑制其表达[31]。Li等采用定量磷酸化蛋白质组学的方法，确定了EphA2、EphB2和EphB4在肺癌中为达沙替尼的作用靶点[32]。虽然达沙替尼在未经基因筛选的晚期NSCLC患者中的Ⅱ期研究疗效并不理想，但它可能适用于对达沙替尼敏感的NSCLC患者亚群，或用于非小细胞肺癌的综合治疗，这些还需要进一步的研究证实[33]。

XL647是一种口服的多受体酪氨酸激酶抑制剂，抑制对象包括EGFR、VEGFR2、HER2和EphB4。XL647能够抑制细胞增殖，并抑制厄洛替尼耐药的H1975细胞系(L858R和T790 M双突变)中EGFR通路的激活。体内的疗效研究显示，XL647在很大程度上抑制了H1975移植瘤的生长，同时降低了肿瘤EGFR信号通路和肿瘤血管密度。一项XL647对一线治疗、EGFR突变富集的非小细胞肺癌患者的疗效和安全性的II期研究显示，EGFR突变患者在使用XL647作为一线治疗时，有57%的客观缓解率[34]。

EphA3受体被视为肺癌的潜在驱动因素，针对它的药物：Ifabotuzumab，原名KB004，在体外实验中诱导细胞凋亡，激活ADCC，破坏肿瘤血管，抑制骨髓微环境下的生存信号。Ifabotuzumab对人胶质母细胞瘤细胞异种移植瘤有显著抑制效果[35]，然而血液恶性肿瘤患者获益较少[36]，关于肺癌患者的临床实验还未进行。

虽然Eph受体作为靶向药物的研究及临床实验较少，但是其家族的很多成员，例如EphA2、EphA3、EphB3、EphB4等都已被证实密切参与肿瘤的形成、转移以及体内的进展，展示出极大的作为肺癌靶向治疗靶点的潜能，值得我们的进一步探索。

4 小结与展望

越来越多的证据表明Eph受体及Ephrins配体在肺癌发病机制中发挥着复杂作用。在恶性疾病中Eph家族和Ephrin配体显示出对细胞存活、增殖、侵袭和转移以及血管生成等多方面的影响。然而，他们在肺癌中的大部分作用和具体机制尚不清楚，需要进一步的研究。此外，考虑到Eph-Ephrin的双向信号作用，以及在肺中多种细胞类型(人肺癌细胞、内皮细胞、免疫细胞等)的普遍表达，Eph/Ephrin的靶向治疗药物设计要避免在体内的非靶向作用，进行系统而全面的临床实验及分析，确保药物的精准作用和用药安全。

1 Siegel R，Ward E，Brawley O，et al.Cancer statistics，2011：the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths[J].Ca：A Cancer J Clin，2011，61(4)：212-236.

2 Chen W，Zheng R，Baade PD，et al.Cancer statistics in China，2015[J].CA：A Cancer J Clin，2016，66(2)：115.

3 Yamagata N，Shyr Y，Yanagisawa K，et al.A training-testing approach to the molecular classification of resected non-small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res，2003，9(13)：4695-4704.

4 Janes PW，Nievergall E，Lackmann M.Concepts and consequences of Eph receptor clustering[J].Semin Cell Dev Biol，2012，23(1)：43-50.

5 Himanen JP.Ectodomain structures of Eph receptors[J].Semin Cell Dev Biol，2012，23(1)：35.

6 Flanagan JVP.The Ephrins and Eph receptors in neural development[J].Annu Rev Neurosci，1998，21(21)：309.

7 Greenman C，Stephens P，Smith R，et al.Patterns of somatic mutation in human cancer genomes[J].Nature，2007，446(7132)：153.

8 Davies H，Hunter C，Smith R，et al.Somatic mutations of the protein kinase gene family in human lung cancer[J].Cancer Res，2005，65(17)：7591.

9 Ding L，Getz G，Wheeler DA，et al.Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma[J].Nature，2008，455(7216)：1069-1075.

10 Wood LD，Calhoun ES，Silliman N，et al.Somatic mutations of GUCY2F，EphA3，and NTRK3 in human cancers[J].Hum Mut，2006，27(10)：1060.

11 Lisabeth EM，Fernandez C，Pasquale EB.Cancer somatic mutations disrupt functions of the EphA3 receptor tyrosine kinase through multiple mechanisms[J].Biochemistry，2012，51(7)：1464-1475.

12 Brannan JM，Dong W，Prudkin L，et al.Expression of the receptor tyrosine kinase EphA2 is increased in smokers and predicts poor survival in non-small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res，2009，15(13)：4423-4430.

13 Faoro L，Singleton PA，Cervantes GM，et al.EphA2 mutation in lung squamous cell carcinoma promotes increased cell survival，cell invasion，focal adhesions，and mammalian target of rapamycin activation[J].J Biol Chem，2010，285(24)：18575.

14 Macrae M，Neve RM，Rodriguezviciana P，et al.A conditional feedback loop regulates Ras activity through EphA2[J].Cancer Cell，2005，8(2)：111-118.

15 Larsen A，Pedersen MM，Grandal M，et al.Activation of the EGFR gene target EphA2 inhibits epidermal growth factor-induced cancer cell motility[J].Mol Cancer Res，2007，5(3)：283-293.

16 Kullander K，Klein R.Mechanisms and functions of Eph and Ephrin signalling[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2002，3(7)：475.

17 Nasreen N，Mohammed KA，Lai Y，et al.Receptor EphA2 activation with EphrinA1 suppresses growth of malignant mesothelioma(MM)[J].Cancer Lett，2007，258(2)：215-222.

18 Lee HY，Mohammed KA，Peruvemba S，et al.Targeted lung cancer therapy using EphrinA1-loaded albumin microspheres[J].J Pharm Pharmacol，2011，63(11)：1401-1410.

19 Ji XD，Li G，Feng YX，et al.EphB3 is overexpressed in non-small-cell lung cancer and promotes tumor metastasis by enhancing cell survival and migration[J].Cancer Res，2011，71(3)：1156-1166.

20 Guo L，Ji XD，Hong G，et al.EphB3 suppresses non-small-cell lung cancer metastasis via a PP2A/RACK1/Akt signalling complex[J].Nat Commun，2012，3(2)：667.

21 Kumar SR，Singh J，Xia G，et al.Receptor tyrosine kinase EphB4 is a survival factor in breast cancer[J].Am J Pathol，2006，169(1)：279-293.

22 Noren NK，Foos G，Hauser CA，et al.The EphB4 receptor suppresses breast cancer cell tumorigenicity through an Abl-Crk pathway[J].Nat Cell Biol，2006，8(8)：815.

23 Miao H，Li DQ，Mukherjee A，et al.EphA2 mediates ligand-dependent inhibition and ligand-independent promotion of cell migration and invasion via a reciprocal regulatory loop with Akt[J].Cancer Cell，2009，16(1)：9-20.

24 Favre CJ，Mancuso M，Maas K，et al.Expression of genes involved in vascular development and angiogenesis in endothelial cells of adult lung[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，285(5)：1917.

25 Wang Y，Nakayama M，Pitulescu ME，et al.Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis[J].Nature，2010，465(7297)：483-486.

26 Yamanda S，Ebihara S，Asada M，et al.Role of EphrinB2 in nonproductive angiogenesis induced by Delta-like 4 blockade[J].Blood，2009，113(15)：3631-3639.

27 Mcnally L，Manne U，Grizzle WE.Post-transcriptional processing of genetic information and its relation to cancer[J].Biotech Histochem，2013，88(7)：365.

28 Peng J，Wang Q，Liu H，et al.EphA3 regulates the multidrug resistance of small cell lung cancer via the PI3K/BMX/STAT3 signaling pathway[J].Tumour Biol，2016，37(9)：11959.

29 Suzuki M，Abe A，Imagama S，et al.BCR-ABL-independent and RAS/MAPK pathway-dependent form of imatinib resistance in Ph-positive acute lymphoblastic leukemia cell line with activation of EphB4[J].Eur J Haematol，2010，84(3)：229-238.

30 Ding L，Shen Y，Ni J，et al.EphA4 promotes cell proliferation and cell adhesion-mediated drug resistance via the AKT pathway in multiple myeloma[J].Tumour Biol，2017，39(3)：1010428317694298.

31 Huang F，Reeves K，Han X，et al.Identification of candidate molecular markers predicting sensitivity in solid tumors to dasatinib：rationale for patient selection[J].Cancer Res，2007，67(5)：2226-2238.

32 Li J，Rix U，Fang B，et al.A chemical and phosphoproteomic characterization of dasatinib action in lung cancer[J].Nat Chem Biol，2010，6(4)：291.

33 Johnson FM，Bekele BN，Feng L，et al.Phase II study of dasatinib in patients with advanced non-small-cell lung cancer[J].J Clin Oncol，2010，28(30)：4609.

34 Pietanza MC，Gadgeel SM，Dowlati A，et al.Phase II study of the multitargeted tyrosine kinase inhibitor XL647 in patients with non-small-cell lung cancer[J].J Thorac Oncol，2012，7(5)：856-865.

35 Day BW，Stringer BW，Alejeh F，et al.EphA3 maintains tumorigenicity and is a therapeutic target in glioblastoma multiforme[J].Cancer Cell，2013，23(2)：238-248.

36 Hughes A，Clarson J，Gargett T，et al.Comment on "KB004，a first in class monoclonal antibody targeting the receptor tyrosine kinase EphA3，in patients with advanced hematologic malignancies：Results from a phase 1 study"[J].Leuk Res，2017，55-57.