气相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中1 6种多环芳烃

于光明 崔宗岩 曹彦忠 李学民 贾光群 张进杰 王宪 高发明

（1 燕山大学环境与化学工程学院，秦皇岛 066004；2 秦皇岛出入境检验检疫局，秦皇岛 066004；3 秦皇岛市卫生学校，秦皇岛 066000）

蜂产品是营养全面的天然保健品，它不仅有调节机体生理机能，提高免疫力，增强体质等功能，还能作为中药辅料治疗和辅助治疗多种顽疾，从而使人健康长寿。我国是世界第一养蜂大国，也是蜂蜜出口大国。然而，自加入WTO后，美国、日本和欧洲作为我国蜂产品的主要出口地区纷纷提出蜂产品中农药、兽药和化学污染物残留限量标准，采取各种技术性贸易措施，致使我国蜂产品出口受到一定程度的限制[1]。

多环芳烃（PAHs）是指由两个或两个以上苯环以线状、角状或簇状排列的化合物，广泛分布于天然环境中，具有较强的致癌、致畸、致突变性。目前，大多数国家都将PAHs列为环境监测的重要内容之一[2]。蜂产品，包括蜂蜜和蜂花粉等，可以作为环境污染的指示标志物[3，4]，环境介质中的PAHs可以通过生物链或其他途径迁移至蜂蜜中，产生一定的残留和污染风险，因而需要建立蜂蜜中多环芳烃化合物的检测方法，对其含量和污染水平进行监控。目前国内外关于测定大气、土壤、水、食品等基质中PAHs的方法较为成熟，主要包括气相色谱-质谱法[5-7]和液相色谱-荧光检测法[8-10]等。国外研究表明，蜂蜜中含有一定量多环芳烃，以小分子非致癌多环芳烃为主[11]。国内测定蜂产品中PAHs残留分析的文献相对较少，其中PAHs的污染水平也缺乏相应的数据支撑。

本文采用固相萃取（SPE）结合气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)法，建立了蜂蜜中16种PAHs的分析方法，该方法具有操作简便，灵敏度高，准确可靠的优点。

1 实验部分

1.1 仪器和装置

美国Thermo Fisher公司的TSQ 8000型气相色谱-串联质谱，配备有TRACE 1310气相色谱仪，Agilent DB-1701色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；日本YAMATO公司SA300型振荡器；美国Organomation公司的N-EVAPTM112型氮吹仪；日本岛津公司生产的TXB622L电子天平；瑞士MettlerToledo公司的XP105分析天平；美国Millipore公司的Milo-Q高纯水发生器；美国 Scientific Industries Vortex Genie 2多用途旋涡混合器。

1.2 试剂和材料

16种PAHs标准品（纯度均≥96.0%，美国SUPELCO公司，详见表1）；准确称取各标准品适量，用甲苯稀释成单标储备液；准确吸取适量各标准储备液于10 ml容量瓶中，用甲苯定容至刻度制成工作液混标，其中各PAHs浓度均为2.0 mg/l，置于冰箱4℃保存。16种PAHs同位素标准品（PAHs-D，纯度均≥98.0%，美国ChemService公司），配制及保存同上，工作液中各PAHs-D浓度均为2.0 mg/l。

丙酮、正己烷、环己烷、乙酸乙酯、甲苯等试剂均为HPLC级，C18固相萃取柱（1 g/6 ml），均购自DIKMA公司；氯化钠，分析纯，天津市大茂化学试剂厂。彩色单道移液枪（2～20 μl，20～200 μl，100～1000 μl，德国Eppendorf有限公司）；津腾公司的0.45 μm滤膜；无水硫酸钠，分析纯，天津市大茂化学试剂厂（650℃干燥4 h后置于干燥器中备用）。所用其他试剂均为分析纯及以上纯度。所有玻璃容器在洗涤后用去离子水冲洗，再用超纯水清洗后烘干备用。

1.3 样品预处理

准确称取5.0 g（精确到0.01 g）蜂蜜样品于80 ml具塞玻璃离心管中，加入PAHs-D内标50 μl。加入50 ml去离子水溶解，涡旋混匀之后，震荡30 min。混匀后上样至C18固相萃取小柱上（预先用6 ml甲醇、6 ml去离子水活化），继续加入20 ml去离子水淋洗，控制流速≤6 ml/min，之后将小柱抽干5 min，然后用10 ml二氯甲烷进行洗脱，洗脱液缓慢吹氮气浓缩至近干，正己烷定容至1.0 ml后进GC-MS/MS检测。

1.4 GC-MS/MS条件

气相色谱条件：进样口温度290℃，载气为高纯He（纯度＞99.999%），流速为1.5 ml/min；进样量1 μl，不分流进样；程序升温：50℃保持1 min，以 30℃/min升温至140℃，然后以10℃/min升温至220℃，接着以5℃/min升温至290℃，保持5 min。

质谱条件：E I源，温度280℃；传输线温度280℃；扫描方式为选择离子反应监测模式（SRM）。16PAHs及内标的定量离子对、定性离子和碰撞能量等信息见表1。

图1 16种PAHs总离子流图

表1 16种化合物及对应同位素内标的串联质谱实验条件

2 结果与讨论

2.1 串联质谱条件优化

在选定的实验条件下，首先通过全扫描方式（Full Scan，m/z 50-550）获得16种多环芳烃的保留时间和一级质谱图，从其中选择丰度较高和质荷比较大的离子作为母离子；在不同碰撞能量下进行二级质谱扫描，从二级质谱图中选择子离子及对应碰撞能量，从而获得特征离子对。

2.2 固相萃取条件优化

根据多环芳烃化合物的性质，选择C18固相萃取柱小柱对蜂蜜样品中目标物进行富集和净化，并选用二氯甲烷为洗脱溶剂，对其用量进行考察。C18小柱活化后加入PAHs混合标准溶液50 μl，然后直接加入二氯甲烷进行洗脱，每2 ml收集洗脱液，缓慢浓缩至近干，正己烷定容至1 ml，分别进样后绘制洗脱曲线见图2。可见，使用8 ml二氯甲烷，即可将16PAHs完全洗脱下来，实际样品洗脱溶剂用量适当放宽，选择为10 ml。

进一步选取某空白洋槐蜜样品，向其中添加浓度为20 μg/kg的PAHs混标，制成阳性样品，并用其对体系pH值、改性剂用量和淋洗剂用量等实验条件进行考察。

样品溶于水后将其pH值分别调节为3.0、4.0、5.0、6.0和7.0，按照上述步骤进行SPE上样、淋洗、洗脱、浓缩和检测。结果表明，在测试范围内蜂蜜样品pH对实验结果无明显影响。由于大多数蜂蜜样品 pH 值在 3.92～5.03 之间[12]，在考察范围内，对PAHs检测无影响，因而实验选择不进行pH调节。

图2 代表性多环芳烃在C18固相萃取柱上的洗脱

表2 16种PAHs的线性范围、线性回归方程以及相关系数

表3 代表性蜂蜜样品的16种PAHs的添加回收率和精密度

样品溶于水后分别加入适量改性剂甲醇，含量分别为0、1%、2%、5%和10%，进行SPE处理和检测。实验结果表明甲醇小于5%时，对PAHs检测无明显影响，而当其含量增加至10%时，目标物回收率略微降低，因而实验确定不加甲醇。

样品溶于水后上样进行SPE富集，然后分别加入不同含量的去离子水进行淋洗，加入量分别为0、5、10、20、30、50 ml，然后抽干、洗脱和检测，结果表明，淋洗剂用量不超过30 ml时，目标物响应无明显影响，但其含量达到50 ml时，目标物响应略有降低，因而实验选择淋洗剂用量为30 ml。

表4 实际蜂蜜样品的16种多环芳烃检测结果，μg/kg

2.3 方法评价

2.3.1 线性及检出限

取适量PAHs工作液混标，加入内标50 μl，用正己烷稀释配置成浓度为10、20、50、100、200、500的系列标准溶液（对应样品浓度为2.0～100 μg/kg），以目标物与对应内标峰面积之比（Y）为纵坐标，以目标物浓度（X）为横坐标，绘制工作曲线，得到16种PAHs的线性范围、线性回归方程以及相关系数（表2）。结果表明，16种PAHs的线性相关系数（r2）均不低于0.995，表明线性关系良好。以3倍信噪比(3S/N)对应浓度为方法检出限，10倍信噪比(10S/N)对应浓度为方法定量限，得到该方法对16种多环芳烃的检出限为0.6 μg/kg，定量限为2.0 μg/kg。

2.3.2 回收率和精密度

选取枣花蜜、荆条花蜜、洋槐蜜、紫云英蜜和椴树蜜为代表性样品基质，在2.0 μg/kg，4.0 μg/kg和20 μg/kg三个添加水平下，按照上述流程进行处理和测定（n=3），得到回收率和精密度数据见表3。结果表明，16种PAHs平均回收率在63.4～122.1%之间，相对标准偏差均小于16%，能够满足日常检测的要求。

2.3.3 实际样品检测

应用本文建立的方法对市售10批蜂蜜样品进行检测，样品类型包括枣花蜜、洋槐蜜、油菜蜜、椴树蜜、荆条蜜、紫云英蜜等，其中7个蜂蜜样品有检出，检出PAHs以萘、苊、菲等小分子多环芳烃为主，具体数据见表4。说明本文方法适用于各类型蜂蜜样品中多环芳烃化合物检测。

3 结论

建立了蜂蜜中16种多环芳烃化合物检测的固相萃取-气相色谱-串联质谱法。方法检出限达到0.6 μg/kg，回收率和精密度良好，方法操作简便，适用于各类型蜂蜜中多环芳烃化合物的测定。

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