NSCLC相关的恶性胸腔积液中VEGF表达及临床意义研究进展

陈 瑶，卢宏达

（1.江汉大学 医学院，湖北 武汉 430056；2.武汉市中心医院 肿瘤科，湖北 武汉 430014）

近年来，随着大气污染的加重和吸烟的流行，肺癌发病率和病死率在全球范围内迅速增高。在我国众多恶性肿瘤中，肺癌已经成为名副其实的“癌症第一杀手”。根据国家癌症中心公布的Cancer Statistics in China，2015显示，在男性肿瘤中，肺癌发病率约占四分之一，居首位［1］。其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌最为常见的类型，约占所有肺癌的85%［1］。恶性胸腔积液（malignant pleural effusion，MPE）是晚期NSCLC患者最常见的合并症之一，常常通过胸水细胞学找到恶性细胞被诊断。MPE的诊断往往提示预后极差，严重影响患者生活质量。已有证据显示，肺癌相关性MPE患者生存期最短，卵巢癌最长，无法找到原发灶的MPE患者生存期介于上述两者之间［2-3］。目前MPE治疗方法有胸腔穿刺引流、胸腔置管引流、胸腔内灌注化疗等，但治疗效果却不尽如人意。因此对于MPE需要更好的治疗方法。

VEGF是一种内皮细胞生长因子，有6个等型，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子（PGF）［4］。在1939年，IDE等［5］提出血管内皮生长因子（vascular endothelial growth fac⁃tor，VEGF）由肿瘤细胞产生。1971年，FOLKMAN［6］首先提出肿瘤生长的血管依赖性理论，即肿瘤的发生发展不仅与肿瘤细胞本身高度增殖的恶性潜能有关，更是离不开肿瘤周边血管的支持，同时提出抗肿瘤血管生成可能起到抗肿瘤的作用。1983年，SENGER等［7］发现血管通透性因子（VPF）证实为血管内皮生长因子。1989年，FERRARA等［8］成功纯化分离VEGF，并确立它在血管生成中的重要作用。1992年，FERRARA等［9］又发现了第一个VEGF受体。随着肿瘤血管生成研究的不断深入，VEGF被确认为肿瘤血管生成中最重要的调控因子，也是引起血管通透性改变和内皮细胞迁移的重要因子，参与肿瘤生长和转移的整个过程，主要通过激活宿主血管内皮细胞，从而刺激肿瘤血管生成，为肿瘤恶性增殖提供必需的氧和营养物质并为肿瘤转移提供通路［10］。VEGF水平也被证实与NSCLC相关性MPE患者的预后相关，是调控NSCLC相关性MPE发生、发展的关键介质［11-12］。NSCLC细胞能够产生VEGF促进胸腔积液的形成、肿瘤的播撒和血管生长素的产生［13］。因此，VEGF在NSCLC引起的MPE的诊断、治疗及预后等方面具有重大意义。

1 VEGF对MPE的诊断价值

MPE诊断的“金标准”是在胸水细胞沉淀物中找到恶性细胞，或在胸膜活检组织中观察到恶性细胞［3，14］。目前诊断MPE的方法有影像学、胸水细胞学、胸膜活检术、某些肿瘤标志物、分子生物技术等，见表1。但上述方法的敏感性和特异性有限［3，15-24］。因此，对于MPE仍需一个敏感度高和特异性强的诊断方法。

分子生物学技术补充了细胞学诊断MPE的不足，比如恶性积液VEGF和endostatin mRNA的表达水平显著高于良性，同时VEGF mRNA的敏感性为82.6%，准确性为84.3%。endostatin mRNA则特异性为100%。TTF-1 mRNA在MPE中检出率为73.2%，敏感度为93%，特异度为100%，精确度为96.6%，在良性中则为0［19-22］。有研究者提出将VEGF作为诊断MPE的指标。2016年FAFLIORA等［16］对VEGF作为MPE的诊断标记物做了一项Meta分析，表明MPE患者积液和血清中较高水平的VEGF有显著差异性，是鉴别良恶性胸腔积液一个有意义的生物标志物。同时检测VEGFR能够提高诊断灵敏度［17］。有研究［18］显示MPE中VEGF和内皮抑素水平升高能提高与结核性胸腔积液相鉴别的灵敏度、特异性和准确性。联合检测癌胚抗原（CEA）和VEGF对NSCLC相关的MPE的诊断有很大的应用价值，但其研究有一定的局限性，仍需进一步探索［24］。

表1 MPE的诊断方法Tab.1 Diagnostic methods for MPE

2 MPE新的病理机制——VEGF

近年来，STATHOPOULOS等［25］提出了一个如图1所示的MPE病理机制模型，表明MPE是肿瘤细胞和宿主细胞相互作用的结果。多种效应分子无论从宿主细胞或肿瘤细胞均参与MPE的发病机制。一般可分为两类：一类是免疫调节因子，包括白细胞介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子（TNF）和干扰素（IFN）；另一类是增加血管通透性的有效调节剂，如血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶（MMPs）等。在这些效应调节剂中，VEGF在胸腔积液的积聚中起着核心作用，通过使血管通透性增加和诱导血管生成来促进MPE的发生发展。这些相互作用产生的免疫调节因子和诱导血管通透性的因子在MPE的形成中起了重要的作用。免疫调节因子包括白介素-2、肿瘤坏死因子（TNF）、干扰素（INF）等，诱导血管通透性的因子有VEGF、金属基质蛋白酶（MMPs）等，其中VEGF在胸膜腔液体累积中起了中心作用［26-28］。而针对VEGF、金属基质蛋白酶（MMPs）为靶点的治疗（血管靶向治疗）可能成为治疗MPE的有效途径。

图1 MPE的病理机制Fig.1 Pathogenesis of MPE

VEGF是一种高度保守的同源二聚体糖蛋白，分子量从35至44 ku不等，能够促进血管增殖、分化、迁移、存活及芽管形成，引起血管通透性的改变，同时控制血管新生［8，29-30］。VEGF每个等型可与3个血管内皮生长因子受体（VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3）的特定组合相结合而发挥多种生物学效应［29，31］。具体来说，受体酪氨酸激酶包括VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3（也分别称为Flt-1，KDR/FLK-1和flt-4）和血管内皮生长因子（VEGF）下游信号转导级联反应的受体介导了VEGF的生物学反应，这些受体和通路在驱动VEGF微阵列中起了中心作用［31］。VEGFR-2介导了VEGF的大部分血管生成反应，包括通透性增加、迁移、侵袭和血管内皮细胞增殖［15］。VEGF/VEGFR-2相互作用可激活下游信号通路来调节内皮细胞的增殖，增加血管的通透性，引起局部水肿和炎症反应，从而促进肿瘤血管的渗透和转移［29，31］。也有很多上游机制引发VEGF在MPE中的表达，如VEGF基因的mRNA的可变剪接至少可产生6个剪接变异体（vegf121-206），具有不同的生物学效应，从而促进新生血管生成［32］。

在各种类型的肺癌中，特别是非小细胞肺癌中，VEGF有较高水平的表达［16-18］。VEGF表达水平受肿瘤局部多种因素的影响，如缺氧、多种生长因子（如表皮生长因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子等）、多种激素等［33-34］。其中，缺氧能使缺氧诱导因子、转录因子等多种因子激活，多方面诱导血管生成［35］。如VEGF mRNA转录启动后与缺氧诱导结合因子-1/芳基烃核转运蛋白启动子区的复合物结合而使VEGF高表达［36］。白细胞介素-6（IL-6）可触发VEGF基因转录，而IL-6本身似乎是许多癌细胞中VEGF靶向基因［37-38］，因此，自分泌信号介导的IL-6可进一步促进VEGF在肿瘤中的分泌，尤其是在非小细胞肺癌细胞中［39］。这也表明许多能诱导IL-6信号转导的刺激最终会触发VEGF水平的升高［39］。

因此，VEGF主要通过增加血管通透性和促血管生成两个方面来调控MPE的发生与发展，其中血管通透性增加是MPE形成的直接原因，促血管生成是间接原因。

3 VEGF靶向治疗MPE研究进展

MPE有效的治疗仍然是目前临床面临的难题和挑战。何种治疗方式对于何种肿瘤引起恶性胸腔积液最为有效、最合适的给药方法/剂量、给药间隔、疗程、长期效果以及联合给用药等均缺乏大样本、随机对照的临床研究。近年来，随着分子靶向药物的研发，特别是抗肿瘤血管生成的靶向药物，如针对血管生长因子的贝伐珠单抗、针对血管内皮细胞的重组人血管内皮抑素，为MPE的治疗提供了新的方向［40］。

3.1 针对血管内皮细胞的重组人血管内皮抑素

3.1.1 研发背景 1997年，O′REINY等［41-42］从小鼠内皮瘤中分离到血管内皮抑素，含有184个氨基酸，分子量为20 ku，对诱导小鼠肿瘤血管生成几乎具有完全抑制作用，显示较强的抗血管活性，且毒副作用轻。国内XU等［43］在Endostatin的基础上加了9个氨基酸，使其药用性能和疗效得到显著提高，成为国家I类新药，从而研究开发了抗肿瘤分子靶向药物重组人血管内皮抑素注射液（Endostar商品名：恩度）。于2005年9月被SFDA批准上市，2006年被《NCCN非小细胞肺癌临床实践指南（中国版）》收录，与化疗联合用于复发和转移NSCLC的治疗［44］，并在临床上得到广泛应用。

3.1.2 恩度的抗血管生成机制 血管内皮抑素可通过多种机制发挥抗肿瘤新生作用：①特异性地作用于新生血管的内皮细胞并抑制内皮细胞迁移，同时诱导其凋亡而发挥抗血管生成作用，间接导致肿瘤休眠或退缩［45］；②神经纤毛蛋白-1（Neuropilin-1，NRP-1）与VEGF均可促进肿瘤微血管生成，且两者的表达呈正相关；SHICHIRI等［46］报道血管内皮抑素可下调VEGF-A、Neuropilin-1等细胞因子，而这些细胞因子与胃癌的发生发展密切相关。阻碍内皮细胞增生与机制蛋白的相互作用，诱导内皮细胞凋亡，同时还可以减少Bcl-2、Bcl-xl抗凋亡蛋白，引起内皮细胞G1停滞，抑制内皮细胞增殖；③可以与VEGF、bFGF等血管生成刺激因子竞争性结合生长因子信号转导系统中的硫酸肝素蛋白聚糖受体，从而抑制血管生成［47］；④可特异性识别并结合内皮细胞表面整合素α5β1、αVβ3等，阻止内皮细胞结合细胞外基质发生黏附移行，抑制肿瘤侵袭转移；诱导黏着斑激酶及桩蛋白的酪氨酸磷酸化作用，并且促进黏着斑和肌动蛋白弹性纤维的形成，从而干扰细胞-细胞间黏附，抑制肿瘤细胞的黏附侵袭［48］；⑤下调基质金属蛋白MMP2/9的表达［49］。有小鼠模型研究表明，内皮抑素过度表达可下调VEGF-C基因，抑制淋巴管生成和肿瘤转移至邻近淋巴结［50］。因此人重组血管内皮抑素是一个多靶点抗血管生成的药物，具有潜在研究前景。

3.1.3 临床研究进展 自2006年恩度上市以来，国内已有多位学者将恩度应用于腔内注射治疗恶性浆膜腔积液，近年来的临床应用认为，恩度单用或联合化疗药治疗恶性浆膜腔积液是安全有效的［51-65］。2011-2013年QIN等［51］开展的腔内应用恩度和或顺铂治疗恶性胸腹腔积液的多中心、随机对照临床研究初步结论显示：恩度单药治疗恶性胸膜腔积液，安全有效；初治患者恩度组和恩度联合顺铂组的疗效优于顺铂单药组。2015年HU等［52］开展了一项重组人血管内皮抑素（恩度）联合顺铂和顺铂单药腔内化疗治疗恶性胸腔积液的临床研究，该研究进一步说明胸腔内注射恩度联合顺铂治疗恶性胸腔积液疗效较好、耐受性佳，能明显改善患者的生活质量。临床上由NSCLC引起MPE最为常见，有许多学者开始探索恩度对NSCLC引起的MPE治疗有效率，并有大量临床数据显示，恩度有效改善了NSCLC相关性MPE患者的生活质量，疗效肯定，不良反应轻微，详见表2［56-63］。

尽管恩度对包括NSCLC相关性MPE在内的肿瘤进展有明显抑制作用，但目前其优化剂量及治疗持续时间颇具争议。在目前临床研究中，恩度均采用7.5 mg/m2，滴注3～4 h，1～14 d。试验研究显示：恩度的抗肿瘤作用具有时间依赖性和浓度依赖性，随着用药时间的延长和血药浓度的逐渐提高，抗肿瘤效果也逐渐提高［64］。KISKER等［55］的研究发现，给小鼠单侧腹腔注射恩度，2 h内恩度很快被清除。而通过微型渗透泵持续给药能使血药浓度长时间保持稳定，而且以单次注射剂量的1/8就可以获得同样的效果，表明恩度持续给药产生的疗效好于相同剂量的短程静脉给药。因此，持续泵入给药方式为进一步提高恩度的抗肿瘤效果和效价比提供了新的思路。

3.2 针对血管生长因子的贝伐珠单抗

3.2.1 研发背景 2004年贝伐珠单抗（Bevacizumab）在国外获得非小细胞肺癌适应症而上市。2015年ZHOU等［65］开展的BEYOND研究结果显示了贝伐珠单抗在中国晚期或复发的非鳞癌NSCLC患者一线治疗中的地位，且在具有VEGFR突变的人群也具有较大的优势。于2015年7月1日贝伐珠单抗被中国CFDA批准用于非小细胞肺癌，也成为了世界上最畅销的抗肿瘤药物之一。

3.2.2 贝伐珠单抗的抗血管生成机制 VEGFA在内皮细胞上的结合位点为VEGFR1和VEGFR2，是两种受体酪氨酸激酶RTK。其中，VEGFR2在VEGFA介导内皮细胞增殖、血管新生和血管通透性过程中起主要作用。VEGFA与VEGFR2结合能够引起受体二聚化和自磷酸化，激活下游多种信号级联通路［66］。贝伐珠单抗是一种人源化的抗VEGFA单克隆抗体，通过阻断VEGFA与其受体结合，抑制其信号通路，从而控制胸腔积液的形成［67-68］。

表2 恩度治疗NSCLC相关性MPE患者的临床疗效Tab.2 Clinical efficacy of Endostar in treatment of MPE in NSCLC patients

3.2.3 临床研究进展 日本一项多中心、单臂、开放性II期前瞻性临床研究探讨了贝伐珠单抗联合紫杉醇/卡铂静脉注射治疗未经化疗的伴有恶性胸腔积液的晚期非鳞NSCLC的疗效［69］，结果显示：伴有恶性胸腔积液的晚期非鳞NSCLC患者接受贝伐珠单抗联合紫杉醇/卡铂治疗2～6个周期后，ORR为60.9%，DCR为87.0%，恶性胸腔积液控制率显著高于单纯化疗组（91.3%和78.3%，P=0.08）［69］。国内LI等［70］探索了局部使用贝伐珠单抗联合铂类治疗恶性胸腔积液的疗效。研究结果显示：在全身紫杉醇化疗的基础上采用贝伐珠单抗联合顺铂胸腔灌注治疗恶性胸腔积液，有效减少了胸腔积液量，明显减少胸腔灌注次数，提高了患者的生活质量，安全性和耐受性良好。同时国内还有许多研究也证实贝伐珠单抗对治疗NSCLC相关MPE的安全有效性（见表3）［71-77］。因此，对于恶性胸腔积液的晚期NSCLC，采用贝伐珠单抗联合含铂双药化疗静脉注射，在治疗原发肿瘤的同时，又能有效地控制恶性胸腔积液，值得临床尝试和进一步探索。

表3 贝伐珠单抗治疗NSCLC相关性MPE患者的临床疗效Tab.3 Clinical efficacy of Bevacizumab in treatment of MPE in NSCLC patients

4 VEGF对晚期NSCLC恶性胸腔积液预后的影响

NSCLC导致MPE形成的主要病理因素是胸膜肿瘤的侵袭［16-19］。VEGF是参与肿瘤侵袭和肿瘤生长全过程的关键因子［10-13］。研究表明，VEGF的表达水平也被证实与NSCLC相关性MPE患者预后相关，VEGF和内皮抑素在胸腔积液中的水平连同血清中的内皮抑素水平，是晚期NSCLC相关性恶性胸腔积液患者潜在的预后参数。重要的是，在一项多元回归分析中显示，胸水中VEGF和内皮抑素水平及血清中的内皮抑素水平被认为是NSCLC相关性MPE患者独立的预后指标［78］，而且MPE中较高水平的VEGF提示有较高的远处转移风险［70］。也有研究认为VEGF表达与NSCLC相关性MPE患者的年龄、肿瘤大小、残余瘤多少以及化疗方式无密切关系，与胸水、胸膜及其他部位转移之间有无关系尚无一致观点［45］。单一的VEGF不足以预测NSCLC相关性MPE患者的预后。这也说明，抗VEGF治疗对NSCLC相关性MPE具有重要的治疗价值，VEGF水平是晚期NSCLC相关性MPE患者的预后指标之一［45］。

5 结语

综上所述，VEGF在NSCLC相关性MPE中的表达研究，无论在诊断和临床治疗上都具有重要的意义。随着分子生物学技术的发展，MPE的诊断在胸腔积液生化分析、细胞病理学和影像检查等的基础上取得了长足的进步，分子生物学技术补充了细胞病理学的不足，提供了更多敏感性高和特异性强的指标。MPE的发病机制复杂，VEGF在一定程度上揭示了MPE的形成机制，同时为MPE的治疗提供了新的靶点。恩度和贝伐珠单抗在中国上市以来，大量研究证实，恩度和贝伐珠单抗等抗血管靶向治疗药物对NSCLC伴MPE的晚期肿瘤患者，不仅改善了患者的生活质量，而且在一定程度上延长了患者生存期，然而准确判断胸水治疗疗效的标准仍然是面临的重要问题，需要更多的大样本研究来进一步证实。目前，越来越多靶向药物的问世，为晚期肿瘤患者改善生活质量及延长生存期带来新希望。

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