大麻素受体1对小鼠脂质代谢的作用研究

魏立雯， 袁章琴， 赵明德， 韩建红， 古从伟， 付陆*

(1.西南医科大学实验动物中心，四川泸州646000； 2. 苏州大学附属第一医院骨科研究所，江苏苏州215006)

随着人类生活水平的提高，肥胖已成为全球性的现代文明病，它是目前发病率急剧上升的一种慢性疾病(王瑾等，2016)。肥胖常伴随多种严重并发症，涉及心血管、神经、呼吸、内分泌和消化等多个系统(汤劐菱等，2007)。因此，世界卫生组织已确认肥胖为一种疾病，并向全世界宣布“肥胖症将是全球首要的健康问题”。深入了解脂质代谢的分子机制，对于改善人体健康、靶向调控脂质代谢紊乱及其诱发的其他代谢性疾病，具有非常重要的意义。

大麻素受体(cannabinoid receptor 1，CB1)是内源性大麻素(endogenous cannabinoid，EC)信号系统的主要受体(胡予等，2007)，在脂质代谢、胰岛素抵抗及葡萄糖摄取等机制中发挥重要作用，与糖尿病、肥胖以及脂肪沉积密切相关(Howlettetal.，2002；Matiasetal.，2006)。利莫那班(SR141716)是CB1受体抑制剂，通过选择性阻断EC信号系统中CB1发挥作用(马微等，2010)。肉碱棕榈酰转移酶1(carnitine palmitoyltransferase-1，CPT1)是脂肪酸β-氧化的关键酶，与脂肪酸分解和体脂含量密切相关(Louetetal.，2001)。CPT1高表达可以促进脂肪酸分解、降低体脂百分比、改善肝脏变性(Mussoetal.，2009)。其中，肉碱棕榈酰转移酶1A(CPT1A)主要在肝脏、肾脏和胰腺表达，主要作用是调节脂肪酸β-氧化、促进脂肪生成，其表达量降低会导致线粒体功能障碍、脂肪肝和肥胖(Drynanetal.，1996；Amengualetal.，2012)。肉碱棕榈酰转移酶1B(CPT1B)主要在心脏和脂肪组织表达，低表达时引起心脏功能障碍、白色脂肪组织的脂肪沉积(Heetal.，2012；Ratneretal.，2015)。

本课题组前期的研究表明，在体外细胞中，CB1通过调控CPT1A和CPT1B的表达影响脂质代谢和脂肪沉积(Zhangetal.，2014)。但是，目前还没有实验研究体内CB1通过对CPT1A、CPT1B作用来调节肥胖和脂质代谢的作用。本研究使用高脂饮食喂养小鼠构建肥胖模型，给予SR141716观察CB1对CPT1A、CPT1B表达的影响，为临床上预防代谢紊乱提供新思路。

1 材料与方法

1.1 构建肥胖模型

选取70只5周龄健康雄性C57BL/6J小鼠，由成都达硕实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(川)2015-030。饲喂于西南医科大学实验动物中心SPF屏障系统，实验动物使用许可证号：SYXK(川)2013-065，温度20～24 ℃，湿度40%～70%，光照时间为08∶00—20∶00。其中,20只给予正常标准饲料，另外50只给予高脂饲料，共16周。收集血液测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)。根据血清生化指标筛选出30只肥胖模型小鼠。

1.2 药物处理及采样

将SR141716溶解在含0.1%Tween-80的蒸馏水中。从标准饲料饲养组中随机选取15只小鼠做空白对照(S-Veh组)，随机将30只肥胖模型小鼠分为2组(D-Veh组、D-SR组)。S-Veh组和D-Veh组灌胃0.1%Tween-80，D-SR组灌胃SR141716(10 mg·kg-1·day-1)，每日测量小鼠体质量，共3周。灌胃实验结束后，颈椎脱臼处死小鼠，采集血液，用于测定生化指标。分离采集各组织样本，生理盐水冲洗后，称量，待RNA和蛋白质提取用。

1.3 血清生化指标检测

运用全自动生化分析仪(ES-480)检测血清中TG、TC、HDL和LDL的含量。使用Multiskan FC酶标仪(Thermo Scientific，USA)，按照ELISA试剂盒(Boster，武汉)检测血清脂联素和瘦素含量。

1.4 总RNA提取和cDNA的制备

使用RNAsimple Total RNA Kit(TianGen，北京)提取试剂盒，按照说明提取各组织总RNA，并通过A260/A280值和1%琼脂糖凝胶电泳判断所提取的RNA质量。使用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大连)反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。

1.5 实时荧光定量PCR

采用2-△△CT法(Vandesompeleetal.，2002)以β-actin和GAPDH作为双内参，在CFX96TMReal-time System上检测CB1、CPT1A和CPT1B基因在各组织中mRNA的表达水平。根据NCBI提供的各基因参考序列，设计荧光定量引物(表1)，由北京六合华大基因有限公司合成。按照SYBR©Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa，大连)试剂盒的使用说明书加样，标准品作为板间对照，并设No-Template Control，每个待测样3个重复。

1.6 Western Blot检测CB1的表达量

使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液(Pierce Biotechnology，USA)提取各组织蛋白质。利用BCA Protein Assay Kit(Life Technologies，USA)测定蛋白质含量。CB1单克隆抗体(Beverly，USA)、β-actin(Santa，USA)以及辣根过氧化物酶标记二抗(Boster，武汉)。Western Blot实验的具体操作方法主要参考Fu等(2016)。

表1 实时荧光定量PCR引物Table 1 The primers used for qPCR

1.7 数据处理

所有数据以Mean±SE表示，运用SPSS 19.0分析处理，组间的差异比较采用单因素方差分析。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 小鼠体质量、肝脏质量、血清生化指标的变化

在药物处理之前，S-Veh、D-Veh和D-SR各组小鼠的平均体质量分别为30.5 g±0.4 g、40.6 g±0.3 g和41.2 g±0.4 g，统计分析发现S-Veh组与D-Veh组、D-SR组之间差异均有统计学意义(P<0.05)，而D-Veh组和D-SR组之间差异无统计学意义(P>0.05)。经过3周SR141716灌胃处理后，各组小鼠的平均体质量分别为28.4 g±0.5 g、36.5 g±0.8 g和30.3 g±1.2 g。与D-Veh组相比，D-SR组小鼠的体质量极显著降低(P<0.01)；与D-Veh组相比，D-SR组小鼠的肝脏质量显著降低(P<0.05)(图1)。同时，血清生化指标分析发现，与D-Veh组相比，D-SR组的TC和瘦素含量显著降低(P<0.05)，HDL和脂联素含量显著升高(P<0.05)，而TG和LDL含量的差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

图1 小鼠体质量和肝脏质量的变化Fig. 1 The change of body mass and liver mass of mice

组别Group甘油三酯TG/(mg·dL-1)总胆固醇TC/(mg·dL-1)高密度脂蛋白HDL/(mg·dL-1)低密度脂蛋白LDL/(mg·dL-1)脂联素Adiponectin/(μg·mL-1)瘦素Leptin/(ng·mL-1)S-Veh256.3±12.881.2±4.848.1±1.523.6±0.720.3±0.96.71±0.48D-Veh168.3±8.9135.4±9.537.2±0.824.8±1.916.7±1.227.43±0.95D-SR175.2±11.6121.7±7.1*55.7±1.9**26.1±1.322.5±1.4*15.62±1.23**

注： D-Veh组和D-SR组相比，*P<0.05，**P<0.01； 下同

Notes： Comparison between D-Veh and D-SR，*P<0.05，**P<0.01； the same below

2.2 SR141716高效抑制CB1的表达水平

qPCR结果表明(图2：a)，与D-Veh组相比，在D-SR组小鼠的皮下脂肪、内脏脂肪、骨骼肌和肝脏组织中，SR141716分别抑制了CB1基因mRNA表达水平的85.1%、87.8%、72.6%和91.3%(P<0.01)。同时，CB1基因mRNA表达水平在S-Veh组和D-Veh组小鼠各组织间的差异有统计学意义(P<0.05)。Western Blot结果表明(图2：b)，CB1蛋白质表达量在D-SR组小鼠的皮下脂肪、内脏脂肪、骨骼肌、肝脏、心脏等组织中明显降低(P<0.05)。

2.3 CB1显著上调CPT1A、CPT1B基因的mRNA表达水平

与D-Veh组相比，CPT1A的表达量在D-SR组小鼠的肝脏中显著上调(P<0.05)，CPT1B的表达量在D-SR组小鼠的皮下脂肪、内脏脂肪、骨骼肌组织中显著上调(P<0.05)(图3)。

图2 小鼠组织中CB1的mRNA(a)和蛋白质(b)表达水平Fig. 2 The mRNA (a) and protein (b) levels of CB1 in mice

图3 小鼠组织中CPT1A和CPT1B的mRNA表达水平Fig. 3 The mRNA levels of CPT1A and CPT1B in mice

3 讨论

CB1是脂质类EC信号系统的主要受体，在脂肪代谢平衡、脑发育、炎症反应、神经系统功能障碍及食欲控制等机制中发挥着重要作用(Matiasetal.，2006；Katona & Freund，2012；Lutzetal.，2015；Lu & Mackie，2016)。SR141716作为CB1受体抑制剂已被商品化为食欲抑制剂、减肥药物(Rinaldi-Carmonaetal.，1994)。Leite等(2009)研究证实SR141716能够促进脂类分解，降低体质量，也可以通过降低TG、游离脂肪酸和TC，增高HDL/LDL比值改善血脂异常状况。

本研究旨在观察CB1对脂质代谢、体质量、肝脏质量、血清中TG、TC、HDL、LDL、脂联素和瘦素含量的影响。结果表明，SR141716灌胃组小鼠的体质量、肝脏质量、血清中TC和瘦素含量显著降低，血清中HDL和脂联素含量增加，然而，血清中TG和LDL含量没有明显改变。本实验研究结果与CB1可以降低体质量、减小腹围、改善肝脂肪变性及血脂异常状况的结论(Tangetal.，2012)基本一致。

大量研究数据证实，外周组织中CB1有望成为治疗肥胖和代谢综合征的新靶点(Crespilloetal.，2010；Silvestrietal.，2011)。前期体外实验证明，SR141716降低了CB1 mRNA水平的表达，但是增加了CPT1A和CPT1B的表达，从而减少了脂肪沉积(Zhangetal.，2014)。研究结果显示，肥胖模型小鼠皮下脂肪、内脏脂肪、骨骼肌和肝脏组织中CB1在mRNA和蛋白质水平均呈现高表达。SR141716灌胃处理后，CB1的表达显著下降，而CPT1A、CPT1B的表达随之升高。CPT1A的高表达主要在肝脏，而在骨骼肌、皮下脂肪、内脏脂肪组织中低表达。与CPT1A相反，CPT1B高表达在骨骼肌、皮下脂肪、内脏脂肪组织，低表达在肝脏。Nogueiras等(2008)的结果也证实，CB1受抑制后上调CPT1，从而促进脂肪分解、抑制脂肪生成。值得一提的是，低水平的CB1可在心脏中检测到，然而本实验中CPT1A和CPT1B在心脏的表达水平非常低，与前期在猪和心肌细胞上的研究结果相反(Zhangetal.，2014)。因此，关于CPT1A和CPT1B在心脏中的作用机制，尚需进一步研究证实。

本研究结论证实CB1通过作用于CPT1A、CPT1B发挥对脂质代谢的调节作用，提高血清中TC、HDL、脂联素和瘦素含量，为靶向调控脂质代谢提供了可靠的依据。

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