PM2.5对人肺癌细胞A549迁移、侵袭能力的增强作用

杨丹，周伟强，杨彪，肖纯凌,*

1. 沈阳医学院 药理学教研室，沈阳 110034 2. 沈阳医学院 辽宁省环境污染与微生态重点实验室，沈阳 110034

PM2.5是指空气动力学直径≤2.5 μm的颗粒物，是构成可吸入颗粒物的主要部分[1]。众多流行病学调查均显示PM2.5与包括肺癌在内的呼吸系统疾病关系密切[2]。长期的PM2.5暴露能明显增加肺癌患者的死亡率，同时可致确诊后的肺癌患者的生存期缩短，说明PM2.5能够促进肺癌的进展[3-4]。肺癌的进展与其转移密切相关，有研究表明：PM2.5可能通过促进肿瘤新生血管形成、诱发炎症反应等促进肺癌转移，但其促进肺癌转移的具体机制仍不清楚[5-7]。以往对于PM2.5致呼吸系统损伤的分子机制的研究多集中于以较高浓度PM2.5所致的细胞损伤作用，而关于PM2.5对肿瘤细胞迁移及侵袭能力影响的实验研究仍较少，因此有必要进行更多及更深入的研究[8-11]。

本研究采用细胞划痕实验和transwell小室法检测PM2.5对人肺癌细胞A549迁移、侵袭能力的影响，以期进一步证实PM2.5具有促肺癌转移的作用。同时本研究采用Western Blotting法检测同细胞迁移、侵袭能力密切相关的Wnt/βcatenin通路活性及其下游cyclin D1、MMP-2、MMP-9和转录因子snail、slug蛋白表达水平的变化，分析该信号通路在PM2.5影响肺癌细胞A549迁移、侵袭能力中的作用，为今后深入研究PM2.5促肺癌转移的机制提供实验依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 细胞株和主要试剂

人肺癌细胞A549购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。胰酶及RPMI 1640培养基(Gibco公司)； Matrigel基质胶(BD公司)；transwell小室(Costar公司)；snail和slug抗体(CST公司)；MMP-2、MMP-9、β-catenin及cyclin D1抗体(Santa Cruz公司)；细胞核蛋白抽提试剂盒(碧云天公司)。

1.2 PM2. 5 采集和处理

选择辽宁省沈阳市为采样地区，采样地点为城市中心。雾霾天气时运用高流量样品颗粒采集器采集PM2.5样品于滤膜上，采样高度为距离地面约1.5 m。连续自动采样6个月，以1.13 m3·min-1流速每48 小时采集1份。采样后的滤膜用铝箔纸包裹后于-20 ℃冰箱中保存。制备PM2.5悬液时将采样后的滤膜剪成约1 cm ×1 cm大小，浸泡在50 mL去离子水中。超声震荡收集PM2.5颗粒物，用多层纱布过滤震荡液后制成PM2.5悬液。收集PM2.5悬液在13 000×g、4 ℃ 的条件下离心10 min后的底层颗粒物，高压灭菌后真空冷冻干燥，-80 ℃保存。染毒前用无菌生理盐水配制成所需的PM2.5混悬液并超声处理[12-13]。

1.3 细胞培养及处理

人肺癌A549细胞株用RPMI 1640培养基(含10%新生牛血清、1% L-谷氨酰胺及1%青链霉素)培养于37 ℃、5 %CO2细胞培养箱中，细胞长满约90%时传代。取对数生长期的A549细胞，接种于培养皿或培养板内，于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h后更换不含血清及抗生素的RPMI 1640培养基。次日向培养基中加入不同浓度PM2.5或TGF-β1(10 ng·mL-1)后持续培养72 h。

1.4 MTT 比色法检测细胞增殖

设立实验组(PM2.5终浓度为2.5、10、40和160 μg·mL-1)、对照组(只加细胞，不加PM2.5)和空白组(不加细胞，只加RPMI 1 640培养基及PM2.5)。体外培养72 h后，每孔加入20 μL MTT (终浓度5 g·L-1)，37 ℃继续孵育4 h，弃上清，每孔加入150 μL DMSO 振荡10 min，用酶标仪在490 nm处测定吸光度(A)值，实验重复3次。按公式计算：

细胞生长抑制率=(A处理组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%

1.5 细胞划痕实验

1.6 Transwell小室侵袭、迁移实验

细胞分组同划痕实验。侵袭实验取200 μL细胞悬液种于铺好Matrigel胶的Transwell上室中，下室加入600 μL含10%血清的培养基，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中孵育24 h，移出transwell小室，棉签擦去上室的非迁移细胞，4%甲醛固定30 min后用0.1%结晶紫染色15 min，冲洗干净后倒置风干。在倒置显微镜下观察并拍照，每个小室随机取6个视野拍照，计数穿膜细胞个数。细胞迁移试验不需要铺Matrigel胶，其余操作同侵袭实验。

1.7 胞核蛋白的抽提

按照细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒说明进行。用PBS洗一遍，刮下细胞，每20 μL细胞沉淀加入200 μL细胞浆蛋白抽提试剂A。最高速剧烈涡旋5 s，冰浴10～15 min。加入细胞浆蛋白抽提试剂B 10 μL，最高速剧烈涡旋5 s，冰浴1 min，4 ℃、13 000×g离心5 min。收集沉淀，加入50 μL细胞核蛋白抽提试剂。最高速剧烈涡旋30 s，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔1～2 min再高速剧烈涡旋30 s，共30 min。4 ℃、13 000×g离心10 min，立即吸取上清，即为抽提得到的细胞核蛋白。

1.8 Western Blotting

收集细胞总蛋白，SDS - PAGE电泳后转印到PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的封闭液常温封闭1 h，加入一抗，4 ℃反应过夜，再用辣根过氧化物酶标记的二抗室温下反应0.5 h，化学发光法显影；利用Image J 软件对目的条带进行灰度值检测，以β-actin为内参照分析蛋白相对表达量。

1.9 统计学处理

2 结果(Results)

2.1 PM2.5对A549细胞增殖抑制作用

PM2.5处理A549细胞72 h后采用MTT 法检测各组吸光度，计算PM2.5对A549细胞的增殖抑制率。如图1和表1所示，与对照组比较，2.5、10、40和160 μg·mL-1PM2.5组对A549细胞的增殖抑制率随浓度升高而增加，分别为(3.08% ± 3.73%)、(10.37% ± 5.97%)、(34.00% ± 6.39%) 和(51.01% ± 8.37%)。 选取对A549细胞增殖抑制作用较弱的2个浓度(2.5 μg·mL-1和10 μg·mL-1)进行后续实验。

图1 PM2.5对A549细胞的生长抑制作用Fig. 1 Inhibition of PM2.5 on growth of A549

表1 PM2.5对A549细胞的生长抑制作用Table 1 Inhibition of PM2.5 on growth of A549

注：与对照组比较，*为P<0.05。

Note： compared with control group，*P<0.05.

图2 PM2.5促进A549细胞的迁移和侵袭注: A为细胞划痕实验检测A549细胞迁移能力(×50)；2B为Transwell法检测A549细胞迁移能力(a～d)和侵袭能力(e～h)(×200) 。Fig. 2 PM2.5 promotes migration and invasion of A549 cellsNote: A showed the migration ability of A549 cells detected by wound healing assay (×50); B showed the migration ability (a-d) and invasion ability (e-h) of A549 cells detected by transwell assay (×200).

图3 Western Blotting 法检测PM2.5 处理72 h后细胞核内β-catenin蛋白表达的变化注：与对照组比较，*为 P<0.05。Fig. 3 The expression levels of β-catenin proteins after exposure to PM2.5 for 72 h were analyzed by Western BlottingNote: compared with control group, *P<0.05.

2.2 PM2.5可增强A549细胞的迁移、侵袭能力

划痕实验结果如图2A和表2所示：划痕后24 h，对照组创面愈合率为(31.97%±1.80%)、2.5 μg·mL-1和10 μg·mL-1PM2.5组创面愈合率分别为(37.59%±3.08%)和(46.34%±5.19%)。与对照组相比，10 μg·mL-1PM2.5组A549细胞的创面愈合率明显增加(P<0.05)。Transwell小室法迁移和侵袭实验结果如图2B和表2 所示：对照组、2.5 μg·mL-1和10 μg·mL-1PM2.5组中穿过基膜的细胞数分别为(118.67 ± 4.5) 个和(32.33 ±2.73) 个，(122.50 ± 6.53) 个和(35.5 ± 5.17) 个，(165.67 ± 6.62) 个和(47.83 ± 2.04) 个。与对照组相比，10 μg·mL-1PM2.5组小室滤膜下表面的细胞个数明显增多(P<0.05)。上述结果表明10 μg·mL-1PM2.5可使A549细胞的迁移、侵袭能力增高。

2.3 PM2.5增强A549细胞Wnt/β-catenin信号通路活性

表2 PM2.5促进A549细胞的迁移和侵袭Table 2 PM2.5 promotes migration and invasion of A549 cells

注：与对照组比较，*为P<0.05。

Note： compared with control group,*P<0.05.

PM2.5处理A549细胞后，Western Blotting 法检测细胞核内β-catenin蛋白表达的变化。结果如图3和表3所示：给予A549细胞2.5 μg·mL-1和10 μg·mL-1的PM2.5处理72 h后，与对照组相比，10 μg·mL-1PM2.5组细胞核内β-catenin蛋白表达水平明显增高(P<0.05)。

2.4 PM2.5上调A549细胞中cyclin D1、snail、slug、MMP-2 和MMP-9的蛋白表达

PM2.5处理A549细胞后，Western Blotting 法检测细胞内cyclin D1、snail、slug、MMP-2 和MMP-9蛋白表达的变化。结果如图4和表4所示：给予A549细胞2.5 μg·mL-1和10 μg·mL-1的PM2.5处理72 h后，与对照组相比，10 μg·mL-1PM2.5组细胞内cyclin D1、snail、slug、MMP-2 和MMP-9的蛋白表达明显增高(P<0.05)。

3 讨论(Discussion)

表3 PM2.5对肺癌A549细胞核内β-catenin蛋白相对表达的影响Table 3 The effect of PM2.5 on the expression of β-catenin protein in A549 cells nucleus (±s，n=6)

注：与对照组比较，*为P<0.05。

Note： compared with control group,*P<0.05.

图4 Western Blotting 法检测加入PM2.5 72 h后细胞内cyclin D1、snail、slug、MMP-2 和MMP-9蛋白表达的变化注：与对照组比较，*为 P<0.05。Fig. 4 The expression levels of cyclin D1, snail, slug, MMP-2 and MMP-9 proteins after treated with PM2.5 for 72 h were analyzed by Western BlottingNote: compared with control group, *P<0.05.

注：与对照组比较，*为P<0.05。

Note： compared with control group,*P<0.05.

肿瘤细胞的转移是肺癌患者复发以及治疗失败的重要原因。以往关于PM2.5对肺癌影响的研究多集中其致癌细胞损伤或者死亡的作用方面[10, 14-16]，而关于PM2.5是否可促进肺癌的早期转移的研究尚少见报道。本研究通过transwell迁移、侵袭实验和细胞划痕实验检测PM2.5对肺癌A549细胞迁移、侵袭能力的影响，结果显示在无血清条件下较低浓度(10 μg·mL-1)的PM2.5作用72 h即可明显增强肺癌细胞迁移、侵袭能力，说明PM2.5可能具有促进肺癌的早期转移的作用。

肿瘤细胞的转移过程非常复杂，涉及多条信号通路、转录因子及酶的活化。Wnt/β-catenin信号传导通路在肿瘤细胞转移过程中起着重要作用，该通路激活时，过量的β-catenin从胞质中转移入细胞核，在核内与转录因子T细胞因子/淋巴增强因子(T cell factor, TCF/lymphoid enhancer factor, LEF)相互作用，激活下游大量具有促进肿瘤细胞转移功能的基因转录，如基质金属蛋白酶、cyclin D1、slug、snail等，进而增强肿瘤细胞转移能力[17-20]。本研究通过检测细胞核内β-catenin的表达水平证明在无血清条件下较低浓度的PM2.5(10 μg·mL-1)作用72 h即可明显激活肺癌A549细胞Wnt/β-catenin信号通路。

基质金属蛋白酶家族是降解细胞外基质的重要酶类。肿瘤细胞周围细胞外基质的降解是肿瘤侵袭和转移的必要条件，因此金属蛋白酶家族在肿瘤细胞迁移和侵袭过程中发挥重要作用。多种肿瘤(包括非小细胞肺癌)中均可见金属蛋白酶家族过表达。基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9是基质金属蛋白酶家族内的重要成员，同属于IV型明胶酶，主要降解细胞间基质及基底膜主要成分IV型胶原，促进肿瘤细胞侵袭和扩散，因此其在肿瘤转移过程中具有重要作用[20-21]。研究表明：Wnt/β-catenin信号通路的激活能够使MMP-2和MMP-9的表达水平增高[18]。如Dong等[22]的研究表明：电离辐射可通过激活Wnt/β-catenin信号通路使其下游包括MMP-2和MMP-9在内的多种基因表达上调，增强胶质瘤细胞U87侵袭能力。本研究中Western Blotting实验结果表明：在无血清条件下较低浓度(10 μg·mL-1)的PM2.5作用72 h即可使MMP-2和MMP-9蛋白表达水平的上调，说明PM2.5增强肺癌A549细胞迁移、侵袭能力作用与其激活Wnt/β-catenin信号通路并通过上调其下游MMP-2和MMP-9蛋白表达相关。

cyclin D1是细胞周期蛋白家族的一个成员，在调控细胞周期进展过程中发挥重要作用，此外cyclin D1还是一个癌基因，在多种肿瘤包括肺癌中呈高表达[23-24]。越来越多的研究表明，cyclin D1与肿瘤的转移关系密切[25]。如Li等[26]的报道称，cyclin D1通过抑制ROCK信号和转移抑制因子TSP-1而增强细胞的运动能力。此外，细胞周期蛋白D1提高MMPs的表达和活性，从而提高侵袭性。如Arato-Ohshima等[27]的研究表明cyclin D1蛋白的过度表达可增加MMP-2和MMP-9的活性并增强脑胶质瘤细胞的侵袭性。

锌指蛋白转录因子snail超家族包括snail(snail 1)和slug (snail 2)2个成员，二者作为转录因子，调控某些基因的表达，如下调细胞间的紧密连接成分如ZO-1及上调肿瘤细胞的金属蛋白酶类的表达，这些均有助于增加细胞的迁徙转移力，尤其常见于各种肿瘤的癌性细胞向远处转移机制中[28-32]。如Wang等[33]的研究表明：snail促进MMP-9表达，并且二者均与甲状腺乳头状癌的淋巴结转移有关。Li等[34]报道snail介导的MMP-2上调与细胞侵袭性增强有关。Qiao等[35]关于口腔鳞状细胞癌的研究证明：snail通过上调MMP-2和MMP-9促进细胞发生上皮间质转化，转移能力增强。Bolos等[36]和Chandler[37]研究发现，slug通过调控靶基因MMP-2影响细胞Ⅳ型胶原和明胶的降解，进而参与肿瘤细胞的侵袭与转移。Qiao等[35]和Yue等[38]报道slug能够上调MMP-9的表达。Wnt/β-catenin信号转导途径可调控snail和slug表达水平，当Wnt信号被激活，稳定的β-catenin进入细胞核内与TCF/LEF相互作用，形成的复合物可使snail和slug转录，核内水平增加[39]。

本研究中较低浓度的PM2.5(10 μg·mL-1)作用72 h即可明显上调cyclin D1、snail和slug的蛋白表达水平，说明Wnt/β-catenin信号通路激活同时上调了某些其下游蛋白的表达，而这些蛋白的高表达又可进一步上调MMP-2和MMP-9的表达，促进肿瘤细胞的转移和侵袭。

综上所述，本研究发现将人肺癌A549细胞在无血清条件下暴露于较低浓度的PM2.5(10 μg·mL-1)72 h，能够使细胞的侵袭、转移能力增强，此作用与PM2.5活化Wnt/β-catenin信号传导通路，上调细胞cyclin D1、MMP-2、MMP-9及转录因子snail和slug的蛋白表达水平有关。

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