甜味蛋白Brazzein及其基因工程

郑伟伟，赵萌，刘波

(齐鲁工业大学 食品科学与工程学院，济南 250353)

近些年来许多流行病的增加都与糖的摄入有关，包括肥胖、糖尿病、高血糖症和龋齿。鉴于此，人们对于安全、健康、天然甜味剂的需求更加迫切。甜味蛋白质作为一种新型的甜味化合物，可以作为天然、低热量的甜味剂。和蔗糖不同，甜味蛋白质不会引起体内胰岛素的变化，因此，它们可能是人工甜味剂、食品和饮料行业中糖类最合适的替代品[1]。

甜味蛋白质通常是从植物中提取的小分子量多肽，它们大多具有超强的甜味，其甜味度约为同摩尔蔗糖甜味的2000～3000倍。目前研究较多的有7种甜味蛋白质：Thaumatin，Monellin，Miraculin，Curculin，Mabinlin，Brazzein以及Pentadin。相比化学合成的甜味剂，它们安全无毒；相比其他的天然甜味剂，它们能量低，又因为甜度高和可以被消化降解为人体所需的天然氨基酸受到越来越多科学家的关注[2]。在这些甜味蛋白质中，Brazzein相对分子质量最小，仅有6.5 kD，具有良好的耐热性和耐pH稳定性，因此Brazzein有可能成为一类新型的具有发展潜力的甜味剂。

1 甜味蛋白Brazzein的来源及生化特性

Brazzein是由Ming和Hellekant从西非热带植物PentadiplandrabrazzeanaBaillon的果实中分离得到的。Brazzein以2种形式存在：其主要存在形式是在氨基末端有焦谷氨酸，而少量形式在氨基末端缺少焦谷氨酸。甜味感官评价结果显示后者的甜度是前者的2倍[3]。

Brazzein 分子是一种小分子量单链蛋白，它含有54个氨基酸残基，在目前发现的7种植物甜味中Brazzein蛋白相对分子量最小，因此研究者更愿意研究它的结构。

Brazzein具有较好的溶解性，并表现出良好的热力学稳定性和pH 值稳定性。Brazzein分子在85 ℃时仍保持折叠形式。人工合成的L-2型Brazzein具有甜味，但是合成的D-2型却不具有甜味[4]。Caldwell等利用NMR研究了Brazzein的结构，结果显示Brazzein包含1个短的α螺旋(残基21～29)和3个反平行的β折叠(strand I，残基5～7；strand II，残基44～50；strand III，残基34～39)，4对二硫键将其分子的所有二级结构相交联(PDB:2BRZ)。

2 Brazzein甜味的决定因素

2.1 包含Arg43的弹性环周围的氨基酸残基

在其他的甜味蛋白中，对甜味重要的氨基酸残基都位于弹性环区域[6]。Brazzein有1个弹性环(残基38～45),包括Phe-Tyr-Asp-Glu-Lys-Arg-Asn-Leu序列。这个环包含Arg43,该氨基酸残基是β转角在strand Ⅱ和 strand Ⅲ之间的中心。有研究指出这个氨基酸残基对于产生甜味是非常必要的[7]。此外，Tyr39, Asp40, Glu41, Lys42和Arg43这些氨基酸残基的化学修饰，也参与了Brazzein甜味的形成。

2.2 带电荷的氨基酸残基

Brazzein极富电荷性和极性，它的序列包括5个天冬氨酸、2个精氨酸、4个谷氨酸、1个组氨酸、7个赖氨酸、6个酪氨酸和2个丝氨酸。这些带电荷氨基酸残基大约占总残基的50%。这些残基的大多数都靠近环或者在N-末端与C-末端区域。Ming等[8]对这些类型的氨基酸残基进行了突变，结果显示这些带电荷的氨基酸残基对于Brazzein的甜味是非常重要的。

Joo-Won Lee等[9]通过定点突变技术设计了多个突变体,他们发现所有的双突变(H31R/E36D，H31R/E41A和E36D/E41A)甜味均比野生型、单突变的甜。而且他们还发现三重突变(H31R/E36D/E41A)的甜味明显比双突变的甜。这些发现表明Brazzein可能与甜味受体表面的多个位点结合。如果减少蛋白质表面整体的负电荷或者增加正电荷，就有可能增加Brazzein的甜味。同样的带电荷和极性的残基对于甜味的重要性在甜味蛋白质Thaumatin和Monellin中也有报道[10]。

2.3 N-末端和C-末端

N-末端参与Brazzein的甜味。N-末端带有葡萄球菌核酸酶(SNase)的Brazzein融合蛋白没有甜味，因此一个体积庞大的N-末端延伸物可能抑制它与受体的相互作用[11]。灵活的C末端是Brazzein与甜味受体作用的主要位点之一，其中C末端的第53位氨基酸对于Brazzein的甜味具有重要作用。该位置氨基酸的大小和侧链的电荷可能赋予了它与甜味受体独特的相互作用[12]。

2.4 其他的因素

Izawa等发现化学合成的Brazzein的甜味依赖于正确折叠的结构。相似的，Kim S H等也发现当甜味蛋白质Thaumatin和Monellin蛋白没有折叠时，甜味也没有了。

对于Brazzein 分子中的半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸、组氨酸和精氨酸的化学修饰,均导致甜味的降低或丧失[13]。Brazzein 的半胱氨酸具有极为重要的结构意义,它们的还原和S烷基化将导致二级结构的解体和三级结构的破坏,从而使其丧失甜味活性[14]。

Cornilescu C等[15]发现低温形式的Brazzein与人类T1R2甜味受体的胞外区域的结合比高温形式结合的更紧密。因为Brazzein与温度有关的氨基酸涉及多个位点，而这些位点对与异二聚体甜味受体的相互作用或者它的甜味都是很重要的。

3 Brazzein的基因工程

因产Brazzein 的植物PentadiplandrabrazzeanaBaillon生长条件苛刻, 在原产地之外不能结实。于是人们便把希望寄托在Brazzein 的基因工程上。迄今为止,Brazzein基因已在数种微生物、真菌和高等植物表达等方面，都取得了一定进展。近几年，国内在基因工程上主要侧重Brazzein的合成和表达，而国外则侧重Brazzein的突变，以寻求性质稳定、甜味更好的突变体。

3.1 Brazzein在原核生物中的表达

Brazzein在原核生物中的表达，主要集中在大肠杆菌，枯草芽孢杆菌和乳酸乳球菌。尤其是在以大肠杆菌作为表达菌的研究中，目的蛋白的产量及生物活性都有了很大提高。

李春丽等[16]于2004 年根据甜蛋白Brazzein 的成熟区氨基酸序列，按照大肠杆菌的密码子偏好性成功构建重组表达载体pET-Bra。经IPTG诱导表达后得到了与预计分子量相同的蛋白，约占细菌可溶性蛋白的12.8%，纯化后的重组蛋白的甜度约是同等重量蔗糖的600倍。张咏春等[17]于2009年在Brazzein肽链中引入31His -Ala的突变, 依照Bacillussubtilis的偏爱密码子,合成了定点突变后的Brazzein 编码序列,并在B.subtilisWB600中实现了可溶性胞内表达,得到了表达量较高的活性蛋白产物。王长远等[18]根据乳酸乳球菌的密码子偏好性，对Brazzein 编码基因进行优化和突变，将优化后的基因克隆入表达载体，在乳酸乳球菌表面成功构建了Brazzein 高水平的表达系统，在乳酸菌表面得到了甜味蛋白。

3.2 Brazzein在真菌中的表达

赵红玲等[19]于2005 年将含有Brazzein 基因的pPIC9K穿梭质粒通过电导入巴斯德毕赤酵母 GS115中，经过IPTG诱导表达后，得到的目的蛋白的分子量与理论值一致，经过小规模的发酵，目的蛋白的含量可以达到385 mg/L，纯化后的目的蛋白可以尝到微的甜味。史勇等[20]对甜味蛋白Brazzein 基因进行改造，采用重叠PCR合成目的基因并克隆到pMD18T 载体，将构建好的重组载体pGAPZαA-Bra用AvrⅡ线性化，电转进入巴斯德毕赤酵母中。通过筛选ZeocinTM阳性克隆菌，进行蛋白表达，SDS-PAGE 结果表明蛋白表达成功。

3.3 Brazzein在植物中的表达

Tomes 等[21]曾构建了Brazzein 基因的植物表达载体，将其在植物中进行表达，但未见确定结果的报道。蒋迪[22]于2002 年人工合成Brazzein 基因，并对生菜和烟草进行了转化，获得了转基因植株及其种子。郭淑华[23]利用农杆菌介导法进行了甜味蛋白Brazzein在番茄中的遗传转化，并利用反转录检测到了Brazzein基因在转基因果实中的转录表达。王克婧等[24]通过农杆菌介导法进行人参果的遗传转化，获得转化再生植株54 株，经检测从中筛选出15株阳性植株，初步确定目的基因已经整合到人参果基因组中。虽然有报道能够将基因的编码序列整合到植物基因组中，也在转录水平检测到了目的基因的转录表达，但在蛋白质水平上表达还不够理想，这可能与基因转录后修饰以及蛋白质修饰有关。

3.4 Brazzein在哺乳动物中的表达

Gordon K等[25]利用转基因的技术在小鼠的乳腺中获得β-酪蛋白，这项技术成功促进了乳腺生物反应器相关技术的快速发展。乳腺生物反应器生产的蛋白不仅活性高，无污染，且具有蛋白的天然活性。阎森[26]在小鼠乳汁中成功表达植物甜味蛋白，并生产出具有生物活性的蛋白，对进一步利用大动物如牛、羊等大规模生产高效活性的甜味蛋白以及利用动物乳腺生物反应器表达其他植物蛋白具有非常重要的借鉴意义。安辰瑞等[27]以人工合成的甜味蛋白Brazzein 基因为基础，成功构建了甜味蛋白Brazzein 基因的乳腺特异性表达载体。

4 研究的意义

Brazzein的研究开发还未成熟, 目前仍处在实验室阶段。但是随着基因工程技术的发展，大规模生产重组甜味蛋白而替代从植物中提取的生产方式，必将促进甜味蛋白质具有更广阔的发展前景。与传统的甜味剂相比，Brazzein有许多优点。例如作为一种高甜度、低热值的非糖甜味剂，Brazzein甜味醇厚，口感好，消化后不会引起血糖升高，不会引起龋齿，安全性好，可以用于食品中增进或改善风味。因此，研究并开发Brazzein具有极其重要的意义，相信在追求健康天然的食品市场中会有巨大的前景。

5 挑战与前景

甜味蛋白Brazzein最终被廉价地推向食品市场, 必然会面临许多挑战。首先，Brazzein是从一种热带植物中分离得到的，但是这种热带植物在其他的环境很难结出果实，从而限制了它的开发和应用,利用化学合成成本又是一个关键性问题；其次就是Brazzein表达过程中所要面临的技术难题；迄今为止，Brazzein已在微生物、真菌、植物和哺乳动物中进行了表达，表达产物或者产量低，或者没有甜味，迄今尚达不到理想的效果；第三，利用基因工程生产的Brazzein最终推向市场还必须经过安全检验，在审批过程中，首先要对Brazzein进行毒理学检测，将基因工程生产的Brazzein与天然Brazzein进行广泛的比较，以确定这两类蛋白的生物学活性是否完全一致；最后，在工业生产中甜味蛋白分离纯化过程成本的控制也是亟待解决的问题。因此，最终将Brazzein廉价安全地推向市场，还有很长的路要走。但随着生物技术的发展，克服这些困难也指日可待。Thaumatin在商业开发中的成功就是一个例证。相信在不远的将来，通过科研工作者和食品开发研究人员的共同努力，甜味蛋白Brazzein一定能够作为一种高效优质的甜味剂走向市场，为食品工业的发展和人类健康做出更大的贡献。

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