细胞块在非小细胞肺癌诊断及基因检测中的运用

陈青 王筱俊 郭广秀 张功亮

1 赣州市人民医院 病理科 （江西 赣州 341000）

2 赣南卫生健康职业学院 （江西 赣州 341000）

内容提要： 目的：探讨细胞块在非小细胞肺癌诊断及基因检测中的意义。方法：收集赣州市人民医院从2015年1月～2018年5月的40例细胞块诊断为非小细胞肺癌病例（细胞学涂片+细胞块HE及免疫组化），其中20例经过纤支镜活检证实。用二代测序法检测EGFR（18、19、20及21号外显子）。结果：其中20例行纤支镜活检的诊断结果与细胞块及免疫组化诊断结果一致。EGFR总突变为30%（12/40），其中21号占58.33%（7/12），19号为41.67%（5/12），两者同时突变8.33%（1/12）。结论：细胞块结合免疫表型可用于标准诊断肺癌及其分类。细胞块可用二代测序法检测EGFR。

肺癌是最常见的恶性肿瘤，并且我国肺癌发病率逐年上升。虽然手术和化疗技术不断提高，但是患者的愈后仍然很差。近年来，多种靶向药物在临床的运用，治疗效果有了明显的提高。针对表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变阳性的肺癌患者，NCCN指南建议的一线治疗方案包括EGFR-TKIs[1]。在肺癌患者，特别是晚期肺癌或周围型肺癌患者、无法对原发病灶进行活检的患者，利用肺泡灌洗液、纤支镜涂片、CT引导下肿物穿刺或胸腔积液作成细胞块，结合细胞形态及免疫表型，可以进行准确的诊断及肿瘤病理分类。为了制定准确的个体化、可靠的靶向治疗方案，细胞块还可以进行分子检测。

1.材料与方法

1.1 材料

选择2015年1月～2018年5月在赣州市人民医院收集的60例细胞块诊断为非小细胞肺癌病例，包括：细胞涂片、细胞块HE及免疫组化。弃去肿瘤细胞少的20例，剩余肿瘤细胞较多的40例，肿瘤细胞占细胞比大于30%并且肿瘤细胞量大于500个。其中胸水20例，纤支镜涂片10例，肺泡灌洗液10例。其中纤支镜涂片及肺泡灌洗液的10例均经活检与组织对照。其中男性25例，女性15例。年龄为35～76岁。

1.2 主要仪器

莱卡ASP300S脱水机；麦新全自动免疫组化仪PathcomSS1；莱卡RM2235切片机；蔡司AX10显微镜。

1.3 试剂

从福州迈新生物技术有限公司购买免疫组化试剂，按实验步骤及试剂说明书操作全自动免疫组化仪。

1.4 方法

（1）收集患者胸水或肺泡灌洗液，放置大约1h。如果胸水或肺泡灌洗液量较多，舍去部分上清液，保留50～200mL沉淀液。将该沉淀液进行离心操作（离心参数：2000r/min，10min）；（2）离心后，舍弃上清液，保留沉淀物。用该沉淀物做细胞学涂片。对临床送检的部分纤支镜涂片进行瑞氏染色。从剩余的纤支镜涂片中刮取细胞制作细胞块。在CT引导下的肿物穿刺吸取的肿瘤组织直接涂片，风干后，进行瑞氏染色。用纱布包裹剩余组织，跟小标本活检组织一起脱水；（3）进行瑞氏染色细胞涂片。再由2名高年资细胞病理主治医师进行阅片，给出细胞学诊断报告；（4）加20mL的10%中性福尔马林固定液到剩余沉淀物内，10～20min后，进行离心沉淀（离心参数：5000r/min，15min）；（5）离心后，放置2～3h，舍去固定液。用纱布将沉淀物包裹后，跟活检小标本一起脱水，然后制作成细胞块；（6）使用常规石蜡包埋技术进行切片，切片厚度为5～8μm。使用苏木精-伊红染色，再使用中性树胶进行封固；（7）由2名高年资细胞病理主治医师进行细胞块HE阅片，选用抗体：TTF-1、CK7、NAPsin-A、P63、P40、CK5/6、EGFR、MC、KI-67、CD68、CA-125、CK20、CEA及CDX-2等；（8）结合细胞学、HE形态及免疫表现进行分析及诊断；（9）EGFR基因检测由金域检验中心代做，采用二代测序法检测EGFR（18、19、20及21号外显子）。

2.结果

40例肺腺癌病例中，其中男性25例，女性15例，其中支气管涂片及肺泡灌洗液各10例，这20例行纤支镜活检，组织学诊断结果与细胞块及免疫组化诊断一致。EGFR总突变为30%（12/40），女性突变率40%（6/15），男性突变率24%（6/25），其中 21号占58.33%（7/12），19号为41.67%（5/12），两者同时突变8.33%（1/12）。

3.讨论

目前，病理组织学检查与诊断是肺癌诊断及EGFR检测的金标准，但是肺癌被确诊时常常已经为Ⅲ、Ⅳ期，无法进行手术治疗，难于获得整块的肿瘤组织。CT或B超引导下肿物穿刺、胸水细胞块制作及电子支气管镜涂片是晚期肺癌诊断及进行基因检测标本来源的主要手段。国内外均有在非小细胞肺癌中用细胞块做免疫组化及EGFR基因检测的相关报道[2,3]。本研究结果显示，细胞块可用于诊断肺癌及其分类；细胞块可用二代测序法进行EGFR基因检测。

EGFR又叫HER-1，为HER家族的成员之一，是一种跨膜糖蛋白，分布于细胞膜的表面，调节细胞的生长发育及抑制细胞的凋亡。大量的研究显示，EGFR在肺腺癌中的表达明显高于鳞状细胞癌及小细胞癌，本研究中EGFR突变为30%，与文献报道相符[4-7]。EGFR突变部位主要位于外显子18、19、20及21，其中外显子19和外显子21突变率占90%以上，本研究也显示相同的结果。外显子19和21的主要突变特征为：外显子19的碱基缺失，从而氨基酸编码序列丢失。外显子21为点突变，位于DGF附近，增强了A-loop的稳定性，第858位密码子的亮氨酸转变为精氨酸，也增强了肿瘤细胞对EGFR-TKIs的敏感性。

文献报道，EGFR突变的高发人群为亚洲女性，不吸烟的肺腺癌患者。本研究也显示女性肺腺癌EGRF突变率大于男性，女性突变率40%，男性突变率24%。另有研究显示原发灶与转移灶中EGFR的突变存在异质性，本研究只检测了原发灶，未进行转移灶的检测，是否存在原发灶与转移灶的突变不一致性，需待进一步研究。