高效液相色谱串联质谱仪的特点和临床应用

方春雪 孙和平

1 长春中医药大学附属医院中医药研究中心 （吉林 长春 130021）

2 吉林省肿瘤医院药物临床试验机构 （吉林 长春 130021）

内容提要： 近年来，高效液相色谱串联质谱技术成为一种发展极为迅速的新兴技术，在医药、化工、食品、农业等领域被广泛应用。因其具有灵敏度高、专属性强、分析时间短及重现性好等特点，也逐渐应用于临床检测和辅助诊断，为精准医疗提供技术支持。

1.总述

随着科学技术的不断发展，质谱检测技术得到飞速的发展。回顾质谱仪的发展史，有几个重要时间节点：①1912年，英国物理学家Thomson研制出了一台简易的质谱仪；②1942年，第一台商用质谱仪产生；③十九世纪八九十年代，科学家相继研发出电喷雾质谱仪及高分辨飞行时间质谱[1,2]。一百多年的质谱发展史，已经有十余个诺贝尔奖授予了与质谱相关研究及应用，足以见其技术的先进性。

液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）的应用涉及了医药、环境、食品、化工等各个行业。该技术结合了液相色谱的良好分离能力和串联质谱的高特异性检测的特点[3]，适于复杂生物样本的分析检测，LC-MS/MS技术在临床诊断方面的发展势头尤为迅猛[4]。

2.LC-MS/MS的工作原理及特点

质谱仪是检测带电物质的质量差异的一类仪器。质谱的检测原理最早由英国物理学家Thomson提出，但是由于受离子化技术的限制，最初的质谱仪仅应用于一些分子量小且热稳定化合物的检测。直到20世纪90年代，电喷雾离子化技术（ESI）及基质辅助激光解析离子化技术（MALDI）的相继开发，才使得生物质谱的研究取得跨越式发展。

2.1 质谱离子源

离子化过程对质谱检测十分关键，只有将分析物变成带电粒子并转移到气相中，才能被质谱仪检测到。目前应用的离子化方法，除了上述提到的ESI及MALDI，还有大气压化学离子化（APCI）和大气压光离子化（APPI）。其中最常用的离子化方法是ESI[5]。

2.2 质量分析器

质量分析器是质谱仪的重要组成部分，其作用是将生成的离子按照质核比（m/z）将不同的待测成分分开。质量分析器主要有以下几种：四级杆质量分析器、离子阱质量分析器及飞行时间质量分析器等。不同类型的质量分析器可以互相组合串联，如四级杆-离子阱串联质谱、四级杆-飞行时间串联质谱等。

2.3 生物样本的LC-MS/MS分析

生物样本的组分比较复杂，因此需要在进行LC-MS/MS分析前对待测样本进行提纯。常用的前处理方法主要有蛋白质沉淀法（PPT）、液液萃取法（LLE）和固相萃取法（SPE）等。

样品经过前处理后，还需要进行适当的分离。目前常用的分离技术有毛细管电泳（CE）、液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）等。生物样本经过前处理，再由HPLC进行色谱分离，在离子源处离子化形成带电离子，然后进入质谱系统。LC-MS/MS分析方法既包含了液相色谱高效的分离速度和更好的分离度，同时也具备了质谱分析的超强的专属性和超高的灵敏度，成为临床检测领域最富有活力的新技术之一。

3.LC-MS/MS技术在临床上的应用

3.1 全谱氨基酸检测

全谱氨基酸在体内处于一个动态平衡，一旦这种平衡被破坏，便会引发人体的众多疾病。全谱氨基酸在体内涉及到免疫、神经系统、激素分泌、物质代谢及能量代谢等诸多环节[6]。因此，其检测对健康评估和疾病诊断具有重要意义[7]。

时正媛等[8]使用UPLC-MS/MS方法建立了人体血清中包括丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、甘氨酸和脯氨酸等在内的13种氨基酸含量测定的方法。以13种同位素标记的氨基酸混合物为内标物质，血清样本用蛋白质沉淀法进行前处理，取上清液进行UPLC-MS/MS分析。分析时间短、特异性强、灵敏度高。为全谱氨基酸检测提供实验依据。

3.2 同型半胱氨酸检测

同型半胱氨酸（HCY）是引起心脑血管疾病的独立危险因素。1969年Mccully提出了高同型半胱氨酸血症能够导致动脉粥样硬化疾病的假说。该假说认为HCY能引起血管内皮系统的损伤，加快血管平滑肌细胞的增殖，对低密度脂蛋白的氧化产生影响，同时增强血小板功能，促进血栓形成。因此，测定HCY对于心脑血管疾病的预防和早期诊断具有重要意义[9]。

赵瑞等[10]收集63例进行HCY检测的血清样本，用LCMS/MS法和循环酶法分别测定了63例血清样本中的HCY浓度。样本前处理中使用三氯醋酸铵作为沉淀剂，线性关系良好，用Spearman法对2种方法进行相关性分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3.3 类固醇激素检测

类固醇激素是一种弱极性的小分子激素，主要由肾上腺、胎盘和生殖腺产生。类固醇激素主要包括雄激素、雌激素、孕激素、糖皮质激素和盐皮质激素等，体内激素水平的变化，可以作为疾病诊断的依据之一。如醛固酮增生症、先天性肾上腺皮质增生、库欣综合征及先天代谢缺陷等，都会导致体内相应激素水平的变化。因此，机体类固醇激素水平的测定，可以作为疾病诊断的依据。

高洁等[11]使用固相萃取技术结合UPLC-MS/MS法建立了快速准确的52种类固醇激素的联合测定方法。其中包括20种雄激素、8种雌激素、10种孕激素及14种糖皮质激素。样品用β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶水解后，经乙腈超声提取，过固相萃取柱，处理后进行UPLC-MS/MS分析。质谱采用电喷雾正/负离子多反应监测模式（MRM）检测，方法简便快捷、专属性强、灵敏度高，为质谱检测类固醇激素提供了可靠依据。

3.4 T3/T4分析

三碘甲状腺原氨酸（T3）/甲状腺素（T4）与甲状腺功能紊乱及甲状腺癌密切相关。人群中大约有4～10%的成人有甲状腺功能紊乱的症状。其中女性甲状腺癌发病率为3～16人/万人，与男性发病率相比，高出约3～4倍。甲状腺癌是一种常见癌症，易于诊断且死亡率低，因此T3/T4的检测对预防甲状腺癌具有重要意义。

人体血液中的T3和T4大部分以结合态存在（约99%），如甲状腺素结合球蛋白（TBG）游离态才有生物活性。临床上通常采用放射性免疫分析法检测T3/T4，但该方法可能会导致假阳性。国际临床化学协会（IFCC）提出要对血清游离甲状腺素的标准化检测方法进行规范，该检测主要基于平衡透析法结合LC-MS/MS进行。足以见得LC-MS/MS分析方法在该检测项目上的必要性。

4.结语

高效液相色谱-质谱联用技术代表当今精准医疗发展方向之一，可实现多种分析物的同时测定，对健康评估和疾病诊断均具有重要意义。