酶法制备血红素对湘式腊肠色泽和挥发性风味的影响

李迎楠+李享+贾晓云+王乐+杨凯+成晓瑜+刘文营

摘 要：将酶解制备的猪血血红素用于加工湘式腊肠，分析添加血红素腊肠的色泽、主体风味和挥发性风味物质的种类和相对含量，并与添加亚硝酸钠的腊肠进行比较。结果表明：单独添加亚硝酸钠使得产品的黄度值（b*）显著升高（P<0.05），而其他色度值与对照组没有显著差异（P>0.05）；添加血红素使得产品的亮度值（L*）、b*和色彩度（C*）顯著降低（P<0.05），血红素添加量为0.20%时会对产品的红度值（a*）、C*和色彩角（h*）产生显著影响（P<0.05）。添加血红素产品的L*较小，添加物质相同时，产品具有相似的b*。产品挥发性风味物质主体成分特征明显，在线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）中，在主成分1和主成分2方向上能将产品进行线性区分，显示了产品间主体风味成分的显著性差异。亚硝酸钠和血红素会对产品中挥发性风味物质的种类和含量产生显著影响，亚硝酸钠使得醇类物质的种类和相对含量降低，酯类、醛类、酮类、酚类、芳香族、烯烃和其他物质的种类和相对含量增加；随着血红素添加量的增加，酯类、醛类和酮类物质的相对含量呈现逐渐增加趋势，酚类、烯烃类、酸类和芳香族类物质的含量则有不同程度的降低。湘式腊肠加工中血红素的添加量控制在0.05%～0.10%时，产品能够获得和添加亚硝酸钠相似的特征。

关键词：猪血血红素；湘式腊肠；色差；电子鼻；气相色谱-质谱仪

Abstract： Hunan-style sausage was prepared with added pig blood hemoglobin prepared by enzymatic hydrolysis of fresh pig blood， and its color， major flavor compounds and volatile composition （type and quantity） were evaluated and compared with those of sausage with added sodium nitrite. The results showed that the addition of sodium nitrite alone significantly increased the a* value （P < 0.05） but did not result in any significant change in other color parameters （P > 0.05） compared with the control group without the addition of pig blood hemoglobin or sodium nitrite. However， the addition of pig blood hemoglobin significantly decreased the L*， b* and C* values （P < 0.05） and significantly affected the a*， C* and h* values at a level of 20% （P < 0.05）. Sausage with added pig blood hemoglobin had a low L* value， and b* values were similar among sausages with added pig blood hemoglobin and among those with added sodium nitrite. Major volatile flavor compounds were distinct among different groups of sausages， and linear discrimination was achieved by linear discriminant analysis （LDA） with the first two principal components （PCs）. The types and contents of volatile flavor compounds in sausage were significantly affected by the addition of sodium nitrite and pig blood hemoglobin. The addition of sodium nitrite reduced the number and relative content of alcohols and increased the contents of esters， aldehydes， ketones， phenols， aromatic compounds， alkenes and other miscellaneous compounds. The relative contents of esters， aldehydes and ketones increased with increasing addition of pig blood hemoglobin， while those of phenols， alkenes， acids and aromatic compounds decreased to different extents. Taken together， sausages with the addition of 0.05%–0.10% pig blood hemoglobin and sodium nitrite were similar with respect to color and volatile flavor components.endprint

Key words： pig blood hemoglobin； Hunan-style sausage； color difference； electronic nose； gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201711008

中图分类号：TS251.93 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2017）11-0045-08

肉制品中添加亚硝酸盐不仅能够抑制微生物生长、增强产品风味，而且有助于产品的发色[1]，也是目前普遍采用的发色手段，但是鉴于亚硝酸盐的潜在毒害作用，其应用受到限制[2]。为顺应肉制品绿色加工的要求，需要对产品的加工工艺进行优化[3-4]，或探索可行的亚硝酸盐替代方案[2，5-6]。

血红素是一类铁卟啉化合物[7]，其在小肠内可以被上皮细胞大量吸收[8-11]，不仅具有补铁等生物功效，而且是一种良好的天然色素[12]。我国猪血资源丰富，2016年我国生猪屠宰量为2.14 亿头[13]，以血液质量占畜体质量的5%计[14]，我国全年的猪血产量约为180 万t。但是，目前我国所产猪血多用于“血豆腐”等食物的加工以及少量生物活性物质的提取。针对血红素的研究主要集中在提取方法上，对血红素在肉制品加工中的应用研究报道较少。针对食物特征性风味的研究，目前多数研究采用电子鼻和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）等技术进行挥发性风味物质的识别、产品分级、鉴定和生产指导等[15-20]，效果显著。

本研究将血红素用于湘式腊肠的加工，并与添加亚硝酸钠加工的腊肠进行对比，分析血红素对腊肠色泽、主体风味和挥发性风味物质的影响，以期为湘式腊肠的绿色制造工艺研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪血 北京资源亚太食品有限公司；猪瘦肉、猪背脂 北京中瑞食品有限公司；食盐、D-异抗坏血酸钠、柠檬酸三钠、三聚磷酸钠、糖和香辛料（均为食品级） 北京新发地农产品批发市场；泸州老窖老头曲（52°） 泸州老窖股份有限公司；胶原蛋白肠衣 中山市百德富肠衣有限公司。

ProtamexTM复合蛋白酶 诺维信（中国）生物技术有限公司；柠檬酸钠、氢氧化钠、盐酸（均为分析纯） 国药集团化學试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

TRACE 1310气相色谱-TSQ 8000质谱仪 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；PEN3电子鼻 德国Airsense公司；CR-400色差计 日本柯尼卡美能达投资有限

公司；Gerstel TDS半自动热脱附进样器 德国Gerstel公司；Cascada BIO纯水机 美国Pall公司；F-120B制冰机 日本星崎电机株式会社；BSA822-CW天平

德国赛多利斯科学仪器有限公司；LCH-18恒温水槽 日本三洋株式会社；CR21G Ⅲ离心机 日本日立株式会社；4822绞肉机 美国Hobart电器公司；ACM搅拌 日本爱工社株式会社；OSCAR-20灌肠机 德国海因里希弗雷机械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血红素的制备

参照文献[21]中的方法。鲜猪血使用0.5%的柠檬酸三钠抗凝后，3 000 r/min条件下离心10 min，收集血细胞沉淀；血细胞经沸水隔水加热10 min变性后均质，用复合蛋白酶于40 ℃、pH 6.0条件下酶解2.5 h，调节pH值为4.0，4 000 r/min条件下离心35 min，收集沉淀，真空冷冻干燥，备用。

1.3.2 湘式腊肠的加工

原料肉中瘦肉与背脂的质量比为7∶3，辅料Ⅰ为食盐2.0%、花椒0.2%、姜粉0.02%、蔗糖2.5%、味精0.5%、白酒2.0%、异抗坏血酸钠0.2%、三聚磷酸钠0.3%和冰水10.0%（均为在原料肉中的质量分数，下同）。参照GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[22]，亚硝酸钠最大设计添加量为0.12‰，辅料Ⅰ与血红素和亚硝酸钠同时加入。实验共设6 个处理组，各组产品配方中血红素和亚硝酸钠的添加量分别为：1）组1，0.06‰亚硝酸钠；2）组2，0.12‰亚硝酸钠；3）组3，0.05%血红素；4）组4，0.10%血红素；5）组5，0.20%血红素；6）组6，0.06‰亚硝酸钠和0.20%血红素。以不添加血红素和亚硝酸钠的产品为对照组。

瘦肉经8 mm孔径绞肉机绞碎，背脂切丁（5 mm），搅拌脱气后灌制，苹果木熏制24 h后，进行低温成熟（温度15 ℃、湿度80%），腊肠出品率为80%。腊肠成熟过程中，每隔24 h进行1 次位置调整，以确保成熟均匀。

1.3.3 产品主体风味物质分析

参照文献[23-24]中的方法。随机均匀称取2.0 g样品于电子鼻样品瓶内，样品分析温度50 ℃，信号采集时间90 s，每个样品均平行测定5 次。电子鼻内置的10 组化学传感器分别对不同官能团的挥发性风味物质产生响应，根据传感器的种类和信号强度可以对样品的风味物质进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）。电子鼻的传感器类型及其响应的物质如图1所示。

1.3.4 产品色泽测定

参照文献[23，25]中的方法。色差计测试孔径为10 mm，每组随机测定15 个样品（总量的1/2）的切面，根据样品颜色的三刺激值（X、Y、Z）计算亮度值（L*）、红度值（a*）、黄度值（b*）、色彩度（C*）和色彩角（h*）[26]。endprint

1.3.5 产品挥发性风味成分分析

参考文献[27]中的方法。每种产品随机选取10 个样品（总量的1/3），剔除肠衣后各取2 g，密闭拍打均匀后取10 g进行挥发性风味物质的富集吸收（50 ℃、0.05 MPa、30 min）及测定；采用峰面积归一化法计算各挥发性风味成分的相对含量。

1.4 数据处理

实验数据均表示为平均值±标准差，采用SPSS软件中的单因素方差分析对数据进行差异显著性分析，采用Winmuster软件进行PCA和LDA，采用Origin 8.0软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同配方腊肠的色泽分析

产品的特征颜色是影响消费者购买意愿的决定性因素之一，其受原、辅料和生产过程工艺参数的影响，尤其是生产过程中添加的亚硝酸钠和色素类物质[28-30]，产品色泽的变化与产品的风味变化息息相关[31]。

由表1可知，不同产品的颜色有明显差异。对照组、组1～6的L*总体呈下降趋势，只添加亚硝酸钠的样品（组1、2）及只添加血红素的样品（组3、4、5）间L*差异均不显著（P>0.05），组1和组3、4间的差异均不显著（P>0.05）；对照组及组1～4样品的a*差异均不显著（P>0.05），组5、6间的差异也不显著（P>0.05），但均显著低于对照组及组1～4（P<0.05），说明添加0.20%血红素对产品的a*产生了显著影响；组1、2产品间的b*差异不显著（P>0.05），且均显著高于组3、4（P<0.05），组3、4样品间的差异不显著（P>0.05），说明产品的b*受添加物种类的影响；对照组及组1、2产品间的C*差异不显著（P>0.05），组3、4产品及组5、6产品间的差异均不显著（P>0.05），说明产品的C*受添加物种类和添加量的影响；对照组及组1～4样品的h*差异均不显著（P>0.05），对照组及组1～3样品的h*与组5间差异不显著（P>0.05），对照组及组1、2与组5、6间的差异也不显著（P>0.05），说明血红素的添加对产品的h*有差异影响。

综上所述，血红素在湘式腊肠中的添加量宜控制在0.05%～0.10%，在此条件下其与所添加的亚硝酸钠呈现的红色更为接近。将血红素应用于腊肠的加工，产品的L*、a*、b*和C*在添加血红素后均呈降低趋势，与改变加工工艺[32]、亚硝酸盐喷雾处理[33]和添加天然色素[24，34]等研究的结果相似。

2.2 不同配方臘肠的主体风味物质分析

腊肠特征性风味的产生与加工过程中添加物质的种类和加工条件等密切相关，亚硝酸钠在促进产品发色的同时，也会对氧化和风味产生影响[1，33]。腊肠成熟过程中脂肪的氧化作用以及蛋白酶的水解过程中产生的反应产物、次级代谢产物和衍生物共同构成了其特征风味[23]。

由图2可知，在PCA中，主成分1和主成分2的方差贡献率分别为95.28%和2.82%，二者的方差总贡献率为98.10%，说明各产品的主体风味均能代表本产品的风味特征，能够通过主成分进行产品间的区分[36]。同时，在主成分1和主成分2方向上，处理组产品间均有一定的交叉，说明其主体挥发性风味物质有一定的相似性。

由图3可知，在LDA中，主成分1和主成分2的方差贡献率分别为68.39%和9.84%，二者的总贡献率为78.23%，说明各产品的主体特征风味也同样适用于LDA。在主成分1方向上，组1、3产品交集较多，说明少量添加血红素（0.05%）与添加亚硝酸钠产品的特征风味更为相似，与2.1节的结果相似。与对照组相比，血红素和亚硝酸钠的添加量越多，产品与对照组在主成分1方向上的差距越大，说明天然色素和亚硝酸钠会影响产品的风味，与已有的研究报道结果相似[33-34]。

2.3 不同配方腊肠的挥发性物质分析

由图4～5可知，产品之间挥发性风味物质的种类和相对含量均存在一定差异。除对照组产品中的醇类物质、组3产品中的酚类物质相对含量较高外，其他产品均为酯类物质的种类和相对含量最高，与2.2节中的PCA结果一致。添加亚硝酸钠使得产品中醇类物质的种类和相对含量均有所降低，酯类、醛类、酮类、酚类和烯烃类等物质的相对含量增加，这可能与亚硝酸钠所呈现出的抑制氧化和增强风味的作用有关[1，30，35，37]。随着血红素添加量的增加，酯类、醛类和酮类等物质的含量呈逐渐增加趋势，而当血红素和亚硝酸盐同时使用时，组6产品中的酯类物质占51.41%、酸类占13.45%、醇类占4.95%、酚类占11.00%，与其他产品相比种类变化明显，说明添加组分在肉制品风味形成中具有重要作用，亚硝酸钠和血红素的添加对腊肠中挥发性物质的种类和相对含量均有影响，与已有文献的报道相似[38]。

由表2可知，7 种产品均检出的挥发性物质有乙醇、己醛、壬醛、醋酸、正己酸、2，3-二甲基-2-环戊烯-1-酮、乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、邻苯二甲酸二甲酯、γ-丁内酯、月桂酸乙酯、愈创木酚、4-乙基愈创木酚、2，6-二甲氧基苯酚等。只在对照组产品中检测到的为正己醇、羟基香茅醇、异戊酸和甲基环戊烯醇酮等；只在组1产品中检测到的为间乙基苯酚和对异丙基甲苯等；只在组2中检测到的为1，2-丁二醇和（E）-13-十八碳烯等；只在组3中检测到的为α-己基肉桂醛、甲氧基丙酮和3-己烯酸乙酯等；只在组4中检测到的为水杨酸甲酯和苯乙酸乙酯等；只在组5中检测到的为异丁醇、正丁醇、桉叶油醇、2-甲基-2-戊烯醛、2-甲基丁醛、异戊醛、2-丁酮、乙酸异丙烯酯和乙酸甲酯等；添加亚硝酸钠和血红素的组6产品中未检测到2，3-丁二醇、乙基环戊烯醇酮、乙酸丁酯、异戊酸乙酯和3-甲基-2-（5H）-呋喃酮等。另外，对照组产品中未检测到乙醛、3-甲基-1，2-环戊二酮和3-羟基-4-甲氧基甲苯，而亚硝酸钠或血红素添加组产品中均检测到这些物质。endprint

产品中的挥发性物质均具有不同的风味特性，如丙酸乙酯有菠萝的气味、醋酸正丙酯具有柔和的水果香味、3-己烯酸乙酯有强烈、持久的青香和果香、水杨酸甲酯具有冬青叶香味、苯乙酸乙酯具有浓烈而甜的蜂蜜香气、玫瑰花香和果香[39-42]，这些种类和含量不同的风味物质共同构成了产品的特征性风味。

3 结 论

血红素和亚硝酸钠对湘式腊肠产品的色泽、主体风味、挥发性物质的种类和相对含量均产生了一定影响。亚硝酸钠的添加使得产品的L*有所降低，b*、C*和h*增加；血红素的添加使得产品的L*、a*、b*和C*均有所降低，而h*呈现增加趋势。不同配方的腊肠在色泽上的区别主要体现在添加血红素加工制得的产品L*较小，产品的a*只有在血红素添加量达到0.20%时才会产生影响，产品的b*呈现受添加物种类影响的特征，产品的C*和h*受添加物种类和添加量的影响。

血红素和亚硝酸钠的添加使得产品的主体风味物质产生差异，在PCA中，产品间的主体风味物质在主成分1和主成分2方向上交集较多，说明不同产品不仅各具特征风味，而且具有一定的相似性；在LDA中，产品主体风味物质在主成分1和主成分2方向上分布较为分散，表明产品间的风味成分差异显著。产品挥发性风味物质中酯类物质的种类和相对含量最多，添加亚硝酸钠会使产品的醇类物质种类和相对含量均有所降低，其他物质的相对含量增加；随着血红素添加量的增加，酯类、醛类和酮类等物质的相对含量呈现逐渐增加趋势。

从产品主体风味和特征色泽来看，湘式腊肠加工中血紅素的添加量控制在0.05%～0.10%时，产品能够获得和添加亚硝酸钠相似的特征。本研究的结果能够为湘式腊肠的加工提供参考，尤其是使用天然色素进行肉制品的绿色加工方面。

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