儿童社区获得性肺炎不同临床类型外周血β-防御素1水平的表达

刘开云， 刘 欢， 张 融， 马爱宁

人β-防御素（HBD）是近些年来发现的一类 极为重要的内源性抗微生物肽，其抗感染功能正逐渐被临床所认识[1]，被认为是抵抗病原微生物侵袭的第一道化学屏障[2-3]，HBD有HBD-1、HBD-2和HBD-3等亚型，其表达可能因感染类型和感染部位而异。虽然对HBD-1在各种感染性疾病中的研究日益深入，但对其在儿童感染性疾病中的研究甚少。儿童社区获得性肺炎（CAP）是小儿呼吸系统最常见的感染性疾病之一，通过对儿童CAP不同临床类型外周血中HBD-1表达水平的研究，探讨其临床意义。

1 材料与方法

1.1 资料来源

2015年2－10月于我院儿科住院的CAP患儿共122例，均符合CAP的诊断标准：发热、咳嗽、呼吸频率增快、呼吸困难、胸壁吸气性凹陷、肺部湿啰音和管状呼吸音等，胸部X线片异常表现包括肺纹理增多增粗、肺部斑片状模糊影、肺实变、肺不张、胸腔积液等，均符合儿童CAP临床表现及影像学特征[4]为CAP组，其中男83例（68.0%），女39例（32.0%）。对照组52例，为同期本院儿外科因腹股沟疝、包茎、精索囊肿等非感染性疾病而择期手术入院的患儿。其中男41例（78.8%），女11例（21.2%）。CAP组与对照组在性别及年龄上无差异。经本院医学伦理委员会批准实施，所有患儿的家属均同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 相关检查 所有CAP患儿入院后按诊疗常规进行相关指标检查：病原学检查、C反应蛋白（CRP）、血常规及X线胸片（或胸部低通量CT）。根据病原学将CAP分组为病毒性肺炎41例，细菌性肺炎35例，肺炎支原体或肺炎衣原体肺炎46例。根据临床表现将CAP分组为重度肺炎39例，普通肺炎83例。临床表现为胸壁吸气性凹陷、鼻翼扇动、呻吟、中心性紫绀、严重呼吸窘迫、拒食或脱水症、意识障碍之一者诊断为重度肺炎[4]，否则为轻度肺炎。CAP患儿按年龄段分：≤6月龄31例，＞6～12月龄32例，＞12～36月龄33例，＞36月龄26例。对照组患儿血清均来自术前常规检查的标本。所有患儿入院后将血清置于-80 ℃保存，以备HBD-1检测。

1.2.2 血清中HBD-1测定 使用南京建成生物有限公司生产的HBD-1试剂盒，用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测患儿血清中HBD-1水平，使用生化仪提取总蛋白，然后采用双缩脲法测定，均在自动生化分析仪上进行， 每次测定均严格进行质控品的同步检测。标准血清HBD-1浓度测定均严格按照ELISA试剂盒说明书操作进行。根据标准曲线及不同样品的总蛋白浓度进行归一化处理后得到标准血清HBD-1蛋白浓度。

试验应用双抗体夹心法测定血清中HBD-1水平：准备试剂、标准血清和标准品，加入准备好的标准血清和标准品，37 ℃反应30 min；洗板5次，加入酶标试剂，37 ℃反应30 min；洗板5次，加入显色液A、B，37 ℃显色10 min；加入终止液，15 min之内用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（D值），通过标准曲线计算标准血清中人HBD-1浓度（μg/L）。

1.2.3 呼吸道病毒检测 使用北京贝尔生物工程有限公司生产的系列呼吸道病毒检测试剂盒，包括人呼吸道合胞病毒、人副流感病毒、腺病毒、A型流感病毒、B型流感病毒IgM抗体检测试剂盒，用ELISA体外定性检测患儿血清中的呼吸道病毒IgM抗体。

1.2.4 肺炎支原体、肺炎衣原体抗体检测 使用深圳市安群生物工程有限公司生产的肺炎支原体、肺炎衣原体IgM抗体检测试剂盒，用ELISA定性检测患儿血清中的肺炎支原体IgM抗体及肺炎衣原体IgM抗体。

1.2.5 痰培养留取 在抗菌药物使用前，用弯压舌板向后压舌，将棉拭子伸入咽部，患儿经压舌刺激咳嗽时，可喷出肺部或气管分泌物粘在拭子上。将棉拭子密封，立即送至检验科微生物室接种培养。

1.2.6 统计学分析 本次研究所得数据采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，非正态连续变量用中位数（四分位数间距）表示；计量资料以均数±标准差表示；两组间比较采用t检验，多组间比较采用F检验；分类资料组间比较用卡方检验；相关性分析用Pearson法。统计显著水平为P＜0.05。

2 结果

2.1CAP组与对照组比较

两组在性别和年龄上无差异（P＞0.05），两组HBD-1浓度有显著差异（P＜0.05），见表1。

2.2 不同病原体感染

病毒、细菌及肺炎支原体或肺炎衣原体组的CAP组与对照组之间HBD-1水平比较显示：各组在性别上无差异，在年龄上细菌组、肺炎支原体或肺炎衣原体组与病毒组、对照组有差异；不同病原体感染CAP两两之间HBD-1水平比较无显著差异（P＞0.05）；而对照组HBD-1水平低于各病原体组（F=7.719，P＜0.05），见表2。

表1 CAP组与对照组HBD-1比较Table 1 Serum human β-defensin 1 （HBD-1） level compared between community-acquired pneumonia children and control subjects

表2 不同病原体肺炎之间HBD-1比较Table 2 Serum human β-defensin 1 （HBD-1） level in children with community-acquired pneumonia in terms of pathogen

2.3 重度肺炎和轻度肺炎比较

重度肺炎和轻度肺炎比较：两组在性别上无显著差异，在年龄上有显著差异，前者年龄显著小于后者，但两者HBD-1水平差异无统计学意义（P ＞ 0.05），见表3。

表 3 重度肺炎和轻度肺炎HBD-1水平比较Table 3 Serum human β-defensin 1 （HBD-1） level in children with community-acquired pneumonia in terms of disease severity

2.4CAP 不同年龄组HBD-1水平对比

不同年龄组在性别上无差异，＞6个月～12个月组HBD-1显著高于其他组（F=9.818，P＜0.05）

表4 不同年龄组HBD-1水平比较Table 4 Serum human β-defensin 1 （HBD-1） level in children with community-acquired pneumonia by age group

2.5 相关性分析

HBD-1水平与CRP和中性粒细胞计数：HBD-1水平与CRP 相关性r =0.103，P=0.294，两者相关性极低且无效；HBD-1水平与中性粒细胞计数相关性r =0.032，P=0.742，两者相关性极低且无效。

3 讨论

HBD是一类广泛存在于动植物体内的小分子阳离子内源性抗微生物肽，富含半胱氨酸、精氨酸，是生物长期与疾病对抗中进化而来的，参与机体最初防御活动，是极为重要的一类内源性抗菌肽[5]。据半胱氨酸残基的位置和二硫键连接方式，HBD分为α、β、θ 3种，HBD-1存在于哺乳动物的组织细胞中[6]，目前发现6种人HBD，其中HBD-1于1995年由德国学者最先从经受透析治疗的肾衰竭患者的血浆中发现[1]，在以后的研究中发现其基因可在上皮细胞内广泛表达[7]，包括气管、细支气管、肺泡上皮细胞及黏膜下腺体、肾脏、泌尿生殖道、扁桃体及牙龈细胞等。已有研究表明，HBD-1在呼吸道黏膜上皮抵抗微生物入侵、在肺的免疫炎性反应中起着重要作用[5]，且近年来研究发现人HBD-1对益生菌无作用，故不会打破人体肠道菌群的平衡[8]，对HBD的研究有待深入。

本研究中，以CAP患儿为研究对象，发现CAP组与对照组的HBD-1水平有显著差异，CAP中无论细菌、病毒、肺炎支原体或肺炎衣原体组的HBD-1水平远高于对照组，有显著的统计学差异。而病毒组、细菌组及肺炎支原体或肺炎衣原体组的HBD-1水平的两两对照研究，差异无统计学意义。既往研究认为HBD-1基因表达不受脂多糖等炎性因子的刺激，无转录调解因子NFKB的结合位点，故一直以来被认为是固有表达[9]。而新近的研究发现卡介苗能增强体外人肺腺癌细胞（SPC-A-1） HBD-1 mRNA的表达及其抗菌活性，增强表达具有刺激物剂量和时间依赖性[10]。在本研究中HBD-1表达水平在CAP各组之间均无显著性差异，且HBD-1水平与CRP和中性粒细胞计数相关性极低，这表明细菌、病毒、支原体、衣原体等病原体的感染，均能诱导机体HBD-1的表达，对感染的病原体均有广谱的抗微生物活性，在一定程度上参与感染性疾病的全身炎性反应。另据张涛等[11]研究发现，反复肺炎的患儿血清HBD-1显著低于健康对照组；反复肺炎婴幼儿存在血清HBD-1、IgA、IgG水平低下的现象，提示呼吸道免疫防御功能存在障碍，这可能是婴幼儿反复肺炎的免疫因素之一。本研究表明重度肺炎与轻度肺炎外周血HBD-1水平差异无统计学意义，说明其在感染型疾病的表达和应激方面无差异。研究发现新生儿气道黏膜可分泌包括HBD-1在内的内源性抗菌肽，其水平与成人的相当。当存在感染及炎性反应时，HBD-1表达即上调[12]。本研究发现，＞6个月～12个月组HBD-1显著高于其他年龄组，考虑HBD-1为非特异免疫，出生后相对固定，而5～6个月后来自母体的IgG抗体减少甚至消失，感染机会增多，诱导机体HBD-1的表达增加，而作为非特异免疫，随着年龄增长，不断与致病及非特异病原体作对抗，从而导致对HBD-1的消耗。

综上，CAP患儿的HBD-1呈高水平表达，说明HBD-1除了作为机体固有免疫的一部分参与到抗感染过程，而且在获得性免疫方面亦可发挥重要的作用；而在CAP的病毒组、细菌组及肺炎支原体或肺炎衣原体组的组间差异无统计学意义，反映出HBD-1对各类病原体呈现出非特异性的、广谱的抗感染免疫功能。

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