副猪嗜血杆菌免疫机制研究进展

刘燕霏，杨建德



副猪嗜血杆菌免疫机制研究进展

刘燕霏，杨建德通信作者

（天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津 300384）

副猪嗜血杆菌（Hps）是常常存在于猪上呼吸道的革兰氏阴性菌，也是革拉泽氏病的病因，该病是以多发性浆膜炎、关节炎和脑炎为特征的全身炎症感染。近年来，对Hps的天然免疫研究表明，猪肺泡巨噬细胞（PAMs）能够差异地上调与炎症和吞噬有关的多种基因，细胞在接触Hps时会产生多种促炎细胞因子。Hps菌株对PAMs吞噬的易感性和补体的杀菌作用受毒株的毒力表型影响。然而，在有Hps特异性抗体的情况下，强毒株容易被吞噬。抗菌药物在养猪业中被普遍用于治疗和控制革拉泽氏病，一些常见的抗菌药物已被证明可以减少Hps的定植。本文阐述Hps天然免疫和适应性免疫机制的研究现状，以及恩诺沙星对Hps感染保护性免疫应答的潜在影响。

副猪嗜血杆菌；先天免疫；适应性免疫；机制；恩诺沙星

副猪嗜血杆菌（，Hps）是影响养猪业重要的病原菌之一。Hps主要定居在猪呼吸道，在应激或感染等情况下引起发病，多表现为纤维素性多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎以及败血症，又称革拉泽氏病（Glasser’s disease）。该病广泛存在于猪群中，给养猪业造成重大的经济损失[1]。除引起疾病外，Hps还常从健康猪上呼吸道被分离出。到目前为止，关于Hps的毒力与基因型/表型之间的关系尚不清楚。成功的疫苗如细菌素及同源疫苗接种可大大降低死亡率，但由于缺乏交叉保护导致免疫失败的情况也时有发生。Hps与猪宿主的相互作用关系，发病或不发病，仍需进一步研究。最近，反向疫苗学和免疫蛋白质组学分析确定了几个公认的毒力相关基因和免疫原性蛋白存在于不同Hps菌株中。研究表明，用重组抗原免疫小鼠和仔猪，尽管出现很强的血清阳转，但只能部分抵御同源菌株的攻毒试验，对异源菌株缺乏交叉保护[2-3]。

由于疫苗效果不佳，治疗Hps感染可依赖抗菌药物。在Hps感染早期接受抗菌药物的猪通常能够在全身感染中存活下来。更具体地说，恩诺沙星是一种有活性的氟喹诺酮类药物，对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌均有效。恩诺沙星抑制细菌DNA旋转酶（II型拓扑异构酶），阻止DNA超螺旋和复制，从而导致细胞死亡。此外，恩诺沙星还可暂时降低猪上呼吸道中Hps的载量。尽管在不同国家间没有一个标准方法来评价Hps 药物敏感性，但在我国和西班牙，一些分离菌株对恩诺沙星具有耐药性。虽然认为许多Hps菌株对恩诺沙星敏感，但仍要强调在给予给定治疗之前，审慎地使用抗菌素来治疗革拉泽氏病并监测Hps分离株的药物敏感性。恩诺沙星也可抑制对多种细菌包括猪胸膜肺炎放线杆菌的免疫。此外，利用抗生素早期对各种细菌病原体杀灭，阻碍了未来应对感染所必需的保护性免疫应答的产生。很明显，抗菌素直接影响细菌感染，但近来的研究表明抗菌素对免疫应答具有潜在作用[3-5]。本文旨在阐述机体对Hps免疫机制及恩诺沙星的潜在影响。

1 抵抗Hps先天性免疫机制

近年来，关于猪免疫系统及其在疾病中的作用和对感染的保护性免疫方面的了解已经有了很大的突破。猪可通过先天免疫机制对病原微生物立即作出反应，这种免疫机制可能控制感染直至激活适应性免疫系统。Hps感染机体后，先天免疫系统被激活，模式识别受体（PRRs）包括Toll样受体（TLR）识别病原体相关分子模式（PAMPs），产生不同的信号转导途径[6]。细菌入侵也激活补体系统，诱导吞噬细胞的迁移和各种细胞因子的产生，产生抗菌防御机制，通过炎症过程吸引更多的细胞，并协助获得性免疫的激活[7]。

1.1 猪肺泡巨噬细胞（PAMs）

猪肺泡巨噬细胞（PAMs）是抵抗Hps感染的重要防线。从猪中分离的PAMs与Hps作用后，能够上调一些基因的表达，促进细胞因子产生、吞噬作用、吞噬溶酶体形成、信号转导和一氧化氮产生。体外研究表明，无毒力菌株易受PAMs的吞噬作用影响，而强毒株Hps菌株具有抵抗吞噬作用的能力，与对无毒力菌株的吞噬作用机制不同，对强毒株的吞噬作用不依赖于肌动蛋白丝。此外，竞争试验显示，对Hps的吞噬作用可能不依赖于特定的受体，因为对无毒力菌株的吞噬作用不受无毒力或强毒菌株存在的影响[8]。

此外，体内研究表明，与无毒力菌株相比，PAMs对Hps强毒菌株的处理存在延迟，由Hps强毒菌株引起巨噬细胞活化延迟24 h。虽然强毒和无毒力菌株形成的早期内吞体没有差异，但在1 h温育后，无毒力菌株比强毒菌株更易形成成熟的内吞体。Hps强毒抑制早期宿主免疫应答可能导致革拉泽氏病发生。Hps对吞噬作用的干扰很可能与细菌的荚膜有关。此外，在Hps外膜中鉴定出两种毒力相关的三聚体自动转运蛋白（VtaA）抗原VtaA8和VtaA9，即使它们不阻止吞噬作用，也延迟了与巨噬细胞的相互作用[9]。免疫组织化学和免疫过氧化物酶技术研究表明，全身感染后，在浆膜损伤病灶中存在增大的吞噬体，内有Hps降解的抗原。在强毒株感染后，被激活的晚期白细胞应答能够有效地吞噬Hps，这与体外研究相一致，即当Hps内化至巨噬细胞时不能存活[8]。

1.2 细胞因子

参与对Hps炎症反应细胞因子包括白细胞介素（IL）8和IL-6，是由猪气管和血管内皮细胞对Hps反应产生的。由IL-6刺激产生急性反应阶段和由IL-8刺激白细胞的趋化作用代表这些细胞因子对Hps炎症反应的重要作用。此外，在实验感染严重的病猪肺组织中，IL-1α表达增加，而在脾脏、咽淋巴结、肺和脑中，IL-4、IL-10、肿瘤坏死因子（TNF-α）和干扰素γ的表达量显著增高。同样，在体内研究中，超强毒Hps菌株感染的猪体内CD163＋单核细胞比例增加，并能产生大量的促炎细胞因子，如TNF-α、IL-1和IL-6[10]。

1.3 γδT细胞

γδT细胞是天然免疫反应的另一道防线，但在用Hps超强菌株的致死剂量感染实验猪后，体内γδT细胞的数量却减少了。γδT细胞代表着猪体内能够识别未加工的非蛋白类抗原的众多淋巴细胞亚群，这些细胞可引起细胞毒性，产生Th-1和Th-2细胞因子，促进炎症和抗炎免疫反应。γδT细胞的减少可能使猪更易感染Hps[10-11]，这可能揭示出Hps强毒株致病机制的原因之一。

1.4 补体

不依赖抗体的补体活化是宿主最初的防御机制，可导致血管扩张和血管通透性增加，吞噬细胞被吸引至感染部位。补体活化最终在细菌细胞壁上形成攻膜复合物，这种复合物犹如一个孔道，最终导致细菌的溶解。补体的激活可由细菌内毒素如脂多糖、肽聚糖和铁杉酸等引发，不需要抗体，补体即可杀灭无毒力Hps菌株，但强毒株能逃避这种宿主的应答且能抵抗补体介导的杀灭[12]。因此，Hps强毒能抵抗不依赖抗体的补体杀灭作用机制可能是其致病性机制之一，Hps外膜蛋白P2（OmpP2）是抵抗血清作用所必需的[13]。

2 抵抗Hps获得性免疫机制

获得性免疫应答的激活导致细胞因子的产生、T细胞和B细胞的活化以及抗体的产生。获得性免疫应答还为宿主提供了特定的记忆以防随后的同源感染。飞速发展的免疫学技术和对猪免疫细胞群的更详细的了解可详细分析猪体内的抗原特异性免疫反应。尽管对细胞外细菌的保护性免疫在很大程度上依赖于抗体，但为充分发挥免疫力，也需要细胞免疫发挥作用[14]。

2.1 细胞免疫

虽然猪的先天免疫机制提供了最初的保护，但获得性免疫机制提供了再次更具特异性、更持久的防御保护[7]。小鼠体内研究表明，在抗原刺激后，Th细胞分化为Th-1或Th-2细胞，Th-1和Th-2细胞的功能与其细胞因子的产生有关。TH-1细胞通过分泌IL-2和IFN-γ参与细胞介导的炎症功能。Th-2细胞通过分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13，促进抗体的产生，促进嗜酸性粒细胞的增殖和发挥作用。因此，Th-2细胞因子通常与抗体反应有关。Th-2类细胞因子如IL-4在体外也不能刺激猪B细胞和抗体的产生。在强毒菌株实验感染后存活的猪体内，Th-1和Th-2（CD4）细胞的总比例显著上升，而易感猪则表现出CD4 T细胞的减少[15]。在攻毒后1～3 d内，所有猪的细胞毒性T细胞和B细胞数量均显著增加[10]，与Hps感染保护有关的细胞免疫机制还需进一步研究。

2.2 体液免疫

当猪感染Hps时，体液免疫反应通常被激活[7]。这种反应通常包括产生短暂的IgM初次反应，然后是逐渐增加的IgG抗体反应[14]。此外，猪血清中含有Hps特异性抗体的被动免疫证实了体液反应在保护猪免受致命攻击方面的作用[16]。抗体的保护机制似乎来自于抗体的调理作用，Hps需要事先用特异性抗体进行调理，才能被PAMs吞噬，如果细菌被内化，就会被PAMs成功杀死[8]。

尽管Hps常常从猪体分离到，但与其对全身系统感染应答信息相比，对该菌定植免疫应答的了解却知之甚少。研究表明，非强毒Hps具有免疫逃逸机制，如生物膜的形成[17]。生物膜的形成可以保护细菌免受宿主免疫反应的清除，促进无毒力菌株对上呼吸道的定植。此外，无毒力菌株通常容易被PAMs吞噬，且对血清的杀菌作用敏感。这可能会阻止细菌在肺部存活及入侵宿主全身。此外，Hps定植率的增加与其血清抗体的量下降有关。因此，仔猪血清抗体可能调节Hps的定植时间和水平，并与避免全身性疾病发生有关[14]。

3 恩诺沙星对Hps免疫应答的影响

抗菌药物与免疫系统相互作用的大多数报道都是通过小鼠模型发现的[7，14]，这些发现有助于通过与细胞和/或体液免疫反应相互作用，或通过减少引发免疫反应的抗原，来了解抗菌药物的使用如何干扰对特定细菌感染的保护。然而，其作用机制仍需进一步研究，特别是对大型动物而言。例如，恩诺沙星是一种氟喹诺酮类药物，能在吞噬细胞中积累，但与对照组相比，它不影响猪多形核白细胞（PMNs）的趋化作用和对胸膜肺炎、多杀巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌的吞噬作用。然而，恩诺沙星在PMNs和PAMs中对胸膜肺炎放线杆菌的吞噬杀伤作用明显增强[4，14]，这些效应是否也适用于Hps有待于进一步研究。恩诺沙星治疗猪胸膜肺炎时体内保护性体液免疫反应明显受到阻碍，而青霉素或四环素则不影响免疫应答[15，18]。缺乏血清阳转可能与恩诺沙星快速清除接种的胸膜肺炎放线杆菌的高效率有关，足以阻止获得性免疫应答的激活。关于Hps，尽管没有关于抗生素干扰免疫反应的明确报道，但已确认恩诺沙星能够减少Hps在猪上呼吸道载量，干扰Hps在呼吸道的定植可能与对其产生保护性免疫反应有关，因为用低剂量Hps强毒菌株实验接种的猪不易发病[18]。

4 展望

抵抗Hps感染包括猪的先天性免疫和获得性免疫机制的多种成分，其中仍有许多方面尚属未知。Hps毒力因子可使细菌逃避先天免疫机制，侵入全身组织，通过细胞因子活化和吞噬细胞聚集造成严重的浆膜炎症。血清抗体反应通常是在猪耐过全身性感染或接种疫苗后产生，和抵御Hps感染密切相关。在养猪业，由于抗菌药物的普遍使用和用抗菌素来控制革拉泽氏病，抗菌素对免疫反应的影响需要引起相关人员的重视。虽然抗生素治疗可以非常有效地控制Hps感染，但也可能产生耐药现象和干扰对该菌的保护性免疫反应[14，19]。因此，需要进一步研究阐明Hps引发保护性免疫反应、体液免疫及细胞免疫的机制，明确这些机制在保护Hps感染中的作用，来更好地理解抗菌素对免疫应答的影响，这必将有助于研发出控制Hps感染的更为有效的措施，也将有助于开展合理的抗生素治疗实践。

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责任编辑：张爱婷

Research advance on immune mechanism of

LIU Yan-fei, YANG Jian-deCorresponding Author

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

and is the etiological agent of Glasser’s disease, a systemic inflammatory infection characterized by polyserositis, arthritis and meningitis. Recent studies on innate immunity tohave demonstrated that porcine alveolar macrophages (PAMs) are able to differentially up-regulate several genes related to inflammation and phagocytosis, and several pro-inflammatory cytokines are produced by porcine cells upon exposure to. The susceptibility ofstrains to phagocytosis by PAMs and the bactericidal effect of complement are influenced by the virulent phenotype of the strains. However, in the presence of specific antibodies against, virulent strains become susceptible to phagocytosis. Antimicrobials are commonly used in the swine industry to help treat and control Glasser’s disease. Some of the common antimicrobials have been shown to reduce colonization by, thus the paper reviews the research on innate and adaptive immune responses toand discusses the potential effect of enrofloxacin on the development of a protective immune response againstinfection.

innate immunity; adaptive immunity; mechanism; enrofloxacin

S852.61

A

1008-5394（2018）02-0070-04

10.19640/j.cnki.jtau.2018.02.017

2018-01-30

天津自然科学基金项目（07JCYBJC16000）；天津农学院附属动物医院项目（ZH004903）

刘燕霏（1970-），女，副教授，硕士，主要从事预防兽医学方面的教学与研究。E-mail：674383573@qq.com。

杨建德（1969-），男，教授，博士，主要从事预防兽医学方面的教学与研究。E-mail：jiandeyang@126.com。