缺陷型基因组病毒的产生及作用

霍彩云，邢海云，唐玉玲，郭晓桐，杨光辉，李颖鑫，王书扬，胡艳欣

(1.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193； 2.中国奶业协会，北京 海淀 100193)

缺陷型基因组(DefectiveInterferingviruses，DI)病毒是指含有不完整的基因组片段的病毒粒子，这些病毒粒子可以有效地干扰完整具有感染性的子代病毒粒子的产生。DI病毒最早发现于流感病毒中，Von Magnus 在鸡胚中增殖流感病毒时观察到使用过高MOI的病毒接种，得到的新一代病毒的滴度反而下降[1]。近年来，由于其独特的抗病毒功能，使缺陷病毒被越来越多的科学家关注，并且被作为疫苗佐剂广泛的应用于临床中。本文从缺陷病毒的结构、功能、检测方法以及临床应用等方面加以综述，以期为缺陷病毒在临床中的应用提供借鉴。

1 结构

根据结构特征，可将DI病毒分为缺失型和回折型这两种类型：在单股负链RNA病毒中，缺失型DI病毒的产生是由于病毒聚合酶只在基因片段的前端发挥转录作用，或者聚合酶跳过了中间的部分直接到末端开始转录而缺失了基因片段的中间部分，因此亲代基因3端和5端的含有启动子的遗传信息被保留，而含有关键基因的中间部分被删除[2]。回折型DI病毒具有1个环状结构，包含标准基因片段的10%～60%，并且含有标准基因片段不存在的互补末端序列。是其聚合酶在工作过程中脱离了模板，并利用已经转录的片段作为模板继续转录，这一过程就形成了互补的3端到5端片段。回折型又分为Copy back 和Snap-back。Copy back 具有一个环状的结构而Snap-back 中互补的片段占据了差不多整个缺陷病毒的结构[3-4]。近年来研究发现，在PR8-H1N1感染的小鼠体内和病人的上呼吸道组织中均发现了DI病毒的存在[5-6]。流感病毒属于正黏病毒科，结构中包含8个不同的单股负链基因组片段(PB1/PB2/HA/PA/NA/NP /NS/M)，基因组大小约为1 000～2 000个碱基对，共同编译12～14种病毒蛋白，具有感染性的病毒粒子需要包含所有的基因片段，DI病毒含有至少一个缺失的基因片段，因此不具有感染性[7]。到目前为止，DI病毒产生的缺失多发生在PB2、PB1、PA这些编码聚合酶的基因片段和M基因片段。Xue J. 等研究者在最新研究结果中表明H1N1流感毒株中存在HA缺失DI病毒，同时他们还证实了当流感病毒感染细胞时使用较高的感染复数或当感染时间增长时，会产生缺陷型病毒粒子，由于缺陷型流感病毒的结构属于中间部分缺失型，相对于完整的基因片段碱基对要少。因此当使用通用型引物进行PCR扩增病毒基因片段时会产生较小的产物，一般在300～600个碱基对间[8]。在H3N2亚型流感病毒感染小鼠肺组织中也可检测到PB1、PB2、PA基因缺失的DI病毒[9]。总之，不同的流感病毒，产生缺陷型基因组的能力及其来源不尽相同，即使来自同一基因组片段，其基因序列也有可能不同。除流感病毒外，人们在弹状病毒如水疱性口炎病毒(VSV)和狂犬病病毒(RV)、副黏病毒科中的仙台病毒(SeV)、呼吸道合胞体病毒(RSV)和麻疹病毒(MV)，以及沙状病毒科脑膜炎病毒(LCMV)中也发现了缺陷型病毒粒子的存在[10-17]。同时，在正链单股RNA病毒中，如脊髓灰质炎病毒(PV)、甲肝病毒(HAV)、登革热病毒(DENV)、西尼罗河病病毒(WNV)、艾滋病病毒HIV和丙肝病毒(HCV)中都会产生缺陷型病毒粒子[18-21]。

2 功能

DI病毒有两大主要功能，包括干扰正常的完整的病毒的复制和刺激宿主的抗病毒免疫反应。

2.1 干扰正常的完整的病毒的复制 当DI病毒与具有完整感染性的病毒共同培养时，DI病毒需要后者的辅助才能复制，但是由于结构的缩短和其具有的高效的启动子区域使得DI病毒更易于复制，当复制积累到一定程度以后，这些DI病毒能占据大部分的病毒聚合酶和与结构蛋白竞争，从而直接干扰后者的复制[22]。近年来有研究证明，SeV、RSV、VSV、狂犬病病毒和流感病毒中含有的DI病毒粒子都分别能干扰正常完整结构病毒的增殖，使正常病毒的复制降低[23-24]。Timo Frensing等研究者分析了流感病毒感染MDCK细胞后DI病毒对病毒复制的影响，发现PB2缺陷的DI病毒可干扰流感病毒的复制，并且其缺陷基因的RNA主要影响病毒复制的第二步-合成子代病毒粒子vRNA，从而影响细胞培养法生产疫苗的质量[25]。

2.2 刺激宿主的抗病毒免疫反应 大量研究表明，DI病毒能够刺激感染后的细胞激活抗病毒反应，产生干扰素，其中SeV的Cantell亚型是研究缺陷病毒相关干扰素反应的金标准，被用于副黏病毒科病毒在体内体外免疫刺激的研究[7，26-27]。DI病毒粒子能够刺激模式识别受体，包括Toll likE-receptors (TLRs)、RIG-I like receptors (RLRs) 和melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA5)[28-29]。当缺陷病毒被RLRs识别后，激活了下游的IRF3和NF-kB，继而引起I型和III型干扰素、炎性细胞因子和干扰素刺激基因ISGs，如ISG54、 ISG56和 RSAD2的表达。当ISGs在被感染细胞内抑制病毒时，干扰素又通过自分泌和旁分泌影响着周围的细胞以及远端组织的抗病毒反应[30]。炎性细胞因子的表达，如 IL-6、TNF-α和 IL-1β，又促进着炎症和先天性免疫到适应性免疫的过渡。在流感病毒中，NS1蛋白为非结构蛋白，是基因组片段中最短的，主要编码NS1蛋白和NS2蛋白。NS2蛋白又称核输出蛋白，主要在感染晚期出现，存在于成熟病毒粒子中，参与核糖核蛋白复合物的核质输出，具有三大主要功能，包括其在感染早期，可与宿主模式识别受体中的RIG-1结合形成拮抗体，阻断下游IRF信号通路，抑制干扰素的产生，是病毒在早期感染中逃避先天性免疫反应的主要因素之一。Jihye Lee 等研究者在体外条件下KG11毒株会产生可表达分子量为13.2 kD的缺陷型NS1蛋白[31]。相比于全长型NS1蛋白，缺陷型NS1蛋白能够刺激感染细胞激活抗病毒反应，产生干扰素，从而干扰病毒的复制并使其毒力减弱。目前还有研究证明，缺失部分PB2基因后的缺陷病毒能够编译一个小分子蛋白，这个新生成的小分子蛋白能够与抗病毒反应信号通路上的MAVs作用，从而诱导I型干扰素反应[32]。

3 检测方法

对于DI病毒的检测，对其定性时qPCR和基因序列的分析为常规、易操作的检测方法。首先是通过琼脂糖凝胶电泳观察其病毒RNA或cDNA，紧接着测序来检测DI病毒片段[8]。在对其进行定量时，主要采用的是实时荧光定量PCR法，该方法是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析，从而可计算得到模板拷贝值，但是也存在一定的缺点，例如其扩增效率具有引物依赖性、需要标准曲线等。为了克服这些缺陷，有学者建立了反转录微滴式数字PCR法(ddPCR)，它是一种用于检测缺陷型干扰粒子的新方法[33]。ddPCR的原理是：在传统PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即采用Bio-Rad QX200 ddPCR这个平台，应用微流体技术将含有核酸分子的反应体系分成数万个纳米级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或含1个至数个待检核酸分子。经PCR扩增后对每个微滴的荧光信号逐一分析，有荧光信号的微滴判读为1，无荧光信号的微滴判读为0，微流体设备中的扫描装置可计算阳性和阴性微滴，并根据泊松分布原理及阳性微滴个数与比例即可精确得出靶分子的起始拷贝数或浓度。该方法克服了qPCR的一些缺陷，比如不依赖于扩增曲线的循环阈值(Ct)、不受扩增效率影响和不需标准曲线等，具有良好的准确性和重现性。Samantha L. Schwartz等研究者在检测缺陷流感病毒时就通过对这两种方法的比较来进一步证实了ddPCR法的优势[33]。相比于qPCR法仅限于进行不同病毒间相同DI病毒片段的比较，ddPCR检测法不仅可进行不同病毒间相同DI病毒片段的比较，也可进行同一病毒间不同DI病毒片段的比较。该研究认为ddPCR检测法具有高度的灵敏性和较低的变异系数，可精确测定每个样品中模板的拷贝值，实现真正意义上的绝对荧光定量，有利于实现对缺陷病毒的精确测定以及毒株的质量化控制。

4 DI病毒的抗病毒临床应用

DI病毒由于其不具感染性和激活宿主细胞免疫反应的能力，吸引了大量科研工作者对其临床抗病毒功能进行了研究。DI 病毒对VSV和猿猴空泡病毒SFV感染小鼠均有一定的保护作用，而这种保护作用可能与I型干扰素的分泌有关。大量的研究证实在小鼠感染A型流感病毒后，如果其中含有高浓度的缺陷病毒，小鼠体内病毒的含量以及免疫损伤都有所降低[34]。最新研究表明，通过反向遗传学技术重组PR8-H1N1 DI病毒在体内体外均有良好的抗病毒效果，并且还对B型流感病毒感染具有交叉免疫保护作用。其中，244 DI病毒在致死性流感病毒感染小鼠中具有良好的保护作用。该DI病毒来源于流感病毒的PB1片段，通过反向遗传技术嵌入到A/PR/8/34流感病毒而得到[35]。在对小鼠滴鼻注射H1N1/H2N2/H3N2或H3N8病毒前或同时间滴鼻给予244 DI病毒，能够显著减轻感染小鼠的临床症状，并且该244 DI病毒对于感染后的治疗也具有明显的效果。244/PR8不具有毒性并且不会产生临床副作用，其注射过程也不会具有感染性。注射244/PR8病毒会对不同品系、不同年龄阶段的小鼠均产生保护作用。通过对患有严重联合免疫缺陷病小鼠的感染研究，证实了获得性免疫应答虽然不能起到保护作用但是能够有效的清除病毒。DI病毒能够促使干扰素聚集在呼吸道，能够对异源性呼吸道病毒如B型流感病毒、副黏病毒、肺炎病毒等感染的小鼠提供保护作用，因此DI病毒可作为抗流感治疗的潜在的有效的新途径[36]。由于DI病毒的生物学特性，使用蔗糖密度离心法也成为分离DI病毒的一种方法，例如缺陷型水泡性口炎病毒。水泡性口炎病毒属于弹状病毒，通过其基因组大小的不同可将其DI病毒从完整型病毒中分离出来[37]。对于脊髓灰质炎病毒或呼肠孤病毒，DI病毒和标准病毒粒子的生物学特性差异很小，因此需要更为灵敏的方法才能检测到DI病毒，例如脊髓灰质炎病毒和其DI病毒可通过氯化铯梯度离心法分离出[37]。虽然这种方法较为容易的分离出纯DI病毒，但是并不适用于所有类型的病毒，例如流感病毒。由于流感病毒的DI病毒和完整型病毒的尺寸大小差异很小，故蔗糖密度离心法不能有效的进行分离，因此研究者在分离缺陷流感病毒的过程中更多采用的是反向遗传技术[38]。

5 总结与展望

DI病毒在许多病毒中的广泛出现证实了它们在动物病毒生物学方面的重要性，它们核苷酸的缺失以及干扰素活性可在病毒生长调控方面具有重要的作用。通过细胞培养的生物化学研究和实验动物的生物学研究认为，DI病毒对疾病可产生良好的预防和控制效果，特别是人兽共患病，比如A型流感病毒。目前，防控禽流感的方法主要为抗流感药物的使用和疫苗接种。然而，疫苗接种存在一定的局限性，虽然在实践中应用了一些已研发出的疫苗，但是流感病毒所具有的抗原漂移和抗原变异的特点使其毒株不断地变化，从而使疫苗不能有效的对抗其发生变异的毒株。因此，探寻新的抗病毒方法迫在眉睫。DI病毒的良好的抗病毒效果使其成为潜在的免疫佐剂用于疾病中。未来，随着DI病毒的不断深入研究，使其可以应用的更多的疾病防控中，具有广阔的应用和发展前景。