亨德拉病毒实验活动中安全风险评估

张 媛， 张一帜， 李 宁， 王利永， 万建青

(中国兽医药品监察所， 北京 海淀 100081)

病原微生物的风险评估工作是实验室生物安全管理的基础。随着生物技术的发展，世界卫生组织《实验室生物安全手册》(2004年第3版)增加了危险度评估、重组DNA技术的安全利用、感染性物质运输及生物安全保障等新内容[1]。瑞典传染病控制所作为世界卫生组织生物安全控制中心，2007年前就建立了一套较为系统而全面的实验室生物安全评估体系[2]。美国疾控中心和国立卫生研究院在《微生物与生物医学实验室生物安全手册》中对风险评估的内容进行了要求[3]。澳大利亚、新西兰等其他发达国家也都建立了实验室生物安全风险管理标准[4]。

我国实验室生物安全工作于2004年SARS实验室感染事件后才真正得到广泛关注与重视，在实验室生物安全管理中，风险评估是保障生物安全的核心工作。风险评估对确定生物安全防护水平、制定实验室操作规程、编写仪器设备操作程序和管理规定，都具有重要的指导作用。但截至目前，我国建立的风险评估与控制体系中尚未涵盖高等级病原微生物实验室内实验、中试及生产等活动。

为了建立完善高致病性动物病原微生物实验操作相关过程的风险因素的识别和评估体系，课题组按照高等级生物安全实验室风险管理的要求，针对高致病性病原微生物的危害和生物学特性，选取世界动物卫生组织(OIE)和我国农业部都将其列为生物安全4级的亨德拉病毒作为高致病性病原微生物的研究对象，根据《实验室生物安全通用要求》(GB 19489—2008) 及其他相关法律、法规和世界卫生组织等权威机构发布的指南，对感染性因子的特性、实验过程中的生物安全防护、意外安全风险等要素进行风险评估，并提出防控措施。

1 评估对象与依据

1.1 评估对象 在四级生物安全实验室接收、使用、处置亨德拉病毒样本及安保相关过程中的风险识别与控制。

1.2 评估依据 世界卫生组织、世界动物卫生组织、国际标准化组织、国家卫生主管部门和行业权威机构发布的指南、标准及教科书等[5～8]。

2 评估内容

为了防止检测人员在实验过程中发生感染，必须了解感染性因子的特性，注意实验过程中接触感染材料的生物安全防护，明确针对意外事故应采取的防控及应对措施。

2.1 感染性因子的特性 亨德拉病毒属于副黏病毒科亨德拉病毒属。1994年和1995年在澳大利亚的马群中暴发了由副黏病毒引起的疾病，起初称为马麻疹病毒，后来更名为亨德拉病毒。在澳大利亚曾经有两人因感染了亨德拉病毒而死亡[9～11]。果蝠是其自然宿主，感染通常发生在果蝠生育时，此时果蝠体内病毒含量最高[12]。澳大利亚的研究结果显示，频繁接触蝙蝠的人员没有感染的迹象[13]。亨德拉病毒具体的传播方式尚不确定。大部分临床病例都与马及其血液或体液的近距离接触有关，曾在被感染动物组织中分离到亨德拉病毒。

马感染亨德拉病毒后的临床症状与非洲马瘟、马流感、最急性马疱疹病毒感染等相似。病毒损伤肺和脑部，有些感染马因病毒损伤血管，自鼻腔和口腔流出血性分泌物[14]。人感染后主要表现为严重的流感样症状，出现咳嗽、呼吸困难等呼吸系统症状，有的出现神经症状，表现为脑膜炎等症状[15]。

由于亨德拉病毒一旦从实验室中泄漏，其对于实验室工作人员具有未知的风险，对于当地的畜牧业也可能产生影响，因此在进行与亨德拉病毒相关的所有工作都必须在生物安全四级防护水平(BSL-4)下操作。一旦怀疑检测到亨德拉病毒的存在，所有可疑样品都必须在BSL-4实验室中操作。我国已将亨德拉病毒列入BSL-4实验室所从事的病原体名录[16]。

2.2 实验过程中的风险识别与控制 实验过程中的生物安全防护主要集中在个人防护用品的穿脱、样本的接收、样本的使用以及废物的处置几个环节。

2.2.1 个人防护 个人防护操作环节存在的主要风险因素有防护服破损、防护手套漏气、正压防护面罩工作故障等。

个人防护用品的穿戴由2人配合共同完成，穿戴时互相整理和检查，确保防护无漏洞，摘脱时帮助对方消毒和脱卸。发现外层防护服破损后应立即停止实验操作，使用含有效氯5 000 mg/L的消毒液对手套进行消毒，并更换手套，在第一缓冲间脱去外层沾染的隔离衣，实验人员撤离至第二缓冲间，穿上新的防护服回到实验室，并按规定上报情况。如果发现双层防护服破损，同样停止实验并更换手套，如果皮肤暴露需同组人员配合用碘伏或75%乙醇进行消毒处理，然后按照程序退出实验室并上报情况，立即将发生暴露的实验人员送至隔离点隔离观察。

在生物安全实验室中使用的一次性手套，不可再次使用。手套用后进行高压灭菌消毒，然后丢弃。工作人员在完成感染性材料实验离开生物安全柜之前应该脱去外层手套，放入生物安全柜内的高压灭菌袋中。然后更换新手套，以避免污染其他物品。如果发现手套破损，应停止试验操作，用含1%有效氯的次氯酸钠纸巾擦拭手套并脱下后丢弃在生物安全柜中的高压灭菌袋中，再对内层手套进行消毒，然后戴上一层手套继续工作。如果外层和内层手套均发生破损，则将手套均脱下，然后用75%乙醇对暴露的手部皮肤进行消毒处理，按标准程序退出实验室，将发生皮肤暴露的实验人员送至隔离点隔离观察。

当正压送风装置发出缺电报警或停止工作，应停止实验操作，并按标准程序退出。更换另一组实验人员穿戴好个人防护装备后继续工作。

2.2.2 样本的接收、信息核对及开启 毒种和样品的接收必须有上级主管部门的授权和许可，所在单位生物安全委员会对在样品接收、开启实验操作环节存在的主要危险因素进行风险评估后方可接收。接收操作中存在的主要风险因素有样品标识不清楚或丢失、包装不牢固、包装材料不足或不符合要求、操作人员不熟悉接收程序、登记的信息不足或有误、意外失手、体积过大或过小、包装材料损坏、表面已经污染、个体防护不符合规定等。开启操作中存在的主要风险因素有容器损坏、容器体积过大或过小、难以开启、不熟悉容器的开启方法、未按规定的程序和地点开启、消毒剂不敏感或失效、样品与接收登记的不符、样品易产生气溶胶、容器内样品变质产生正压、意外失手等。

实验室应设专人负责接收，设专用冰箱或储存地点。由专人负责并使用安全防护装置，在BSL-4实验室内进行。必须填写接收登记表。实验室应有样品接收和打开样品的程序与操作指导书，包括检查标识和包装的程序、防护要求、开启包装的地点、应急措施等。

样本的接收也应由2人共同完成，需要检查样本外包装是否符合规范，是否有破损和渗漏痕迹，对不符合要求的送检样本一律拒收。将样本运送容器表面喷洒消毒液进行消毒，然后装入密封袋，再对密封袋表面消毒。在生物安全柜中逐层打开标本包装，同时喷洒消毒液，用镊子取出样本内包装，用相机拍摄登记的样本信息和流行病学资料，用电脑传送至实验室外，由外部人员进行信息核对。

2.2.3 样本的使用 样本的实验操作主要包括取样、匀浆、超声处理、组织研磨、离心、移液操作、病原培养、毒种冻干、样品保存等环节。实验操作过程的主要生物风险有溢洒、刺手、产生气溶胶、容器破碎、机械伤害、意外失手、设备异常、失窃等。

如果在样本包装中发现针头或棉棒等，应用镊子将其放入盛有消毒液的锐器桶中；如果针头或污染的吸头掉落在台面或地面，应用消毒剂浸透的纱布覆盖其上，然后用镊子将其归拢、收集并放入锐器桶中。在发生锐器刺伤、切割伤或擦伤等情况时，实验人员立即停止工作，同行操作者及时向监控室报告，监控人员接报后，应立即报告实验室主任和上级领导，由上级领导安排联系定点医院，并准备好适当的交通工具。受伤人员脱掉最外层手套，在同行操作者的配合下用生理盐水冲洗伤口，尽可能冲出损伤处的血液，从急救箱取出急救药品进行包扎，在其他操作者的配合下按照规定程序退出实验室。及时拨打120，送定点医院急救室，告知医生受伤的原因及可能感染亨德拉病毒，根据情况进行医学处理，并留院观察。住院后，和同行的操作者一起，记录受伤原因、可能接触的病原微生物，并保留完整的医疗记录。

感染性液体溅洒在生物安全柜内，用止血钳夹取含氯消毒剂浸湿的纱布覆盖并擦拭，重复操作一次，使用后的纱布置于生物安全柜内的高压灭菌袋中，并开启紫外线灯照射30 min。如果感染性液体溅洒到地面上，用纱布覆盖溢出物和周围区域，从外围向中心倾倒消毒剂进行消毒，反应30 min，用镊子将覆盖物移开并再用含消毒剂的纱布将地面擦拭干净，然后用30 g/L过氧化氢气体对实验室进行终末消毒。当感染性物质溅洒在防护服时，另一操作人员应立即对污染人员所处区域及衣物喷洒消毒液，之后被污染人员脱掉防护服，以防止感染性物质触及皮肤并防止进一步扩散。将已污染的防护服装入垃圾袋中进行高压灭菌处理。洗澡出防护区，撤离实验室，设立警示标记。30 min后穿好个人防护装备，进入实验区，处理污染区域，用含1%有效氯的次氯酸钠喷雾器对发生污染的区域进行消毒。如果手套表面沾染了感染性液体，应用含氯消毒剂对手套进行消毒，脱下手套并对内层手套进行消毒，然后更换新的手套。如感染性培养物或标本组织液外溢到皮肤，视为很大危险，应立即停止工作，在另一操作者的配合下，对溢洒的皮肤采用75%酒精进行消毒处理，然后用清水或肥皂水彻底冲洗。处理后安全撤离，密切观察3周。填写意外事故报告，并报相关负责人。眼睛溅入感染性液体，在另一操作者的配合下，用洗眼器进行冲洗，然后用生理盐水或清水连续冲洗，注意动作不要过猛，以免损伤眼睛。在另一操作者的配合下退出实验室，拨打120，送定点医院留院观察。填写意外事故报告，并报相关负责人。

较大量感染性物质的溅洒、跌落、离心管破裂、超声、匀浆等会产生气溶胶。确认所有防护设备完好的情况下，使用纱布或纸巾覆盖污染的场地并吸收溢出物，喷洒含1%有效氯的次氯酸钠消毒液，并对防护服表面喷洒消毒剂，按规定程序撤出实验室，张贴危险标识以示禁止入内。30 min后由另外人员穿防护服、正压头盔进场处理污染物。如果怀疑受到严重污染，则所有人员暂时撤离现场，30 min后另外人员穿好防护服和正压头盔进场，使用纱布或纸巾覆盖污染的场地并吸收溢出物，喷洒含1%有效氯的次氯酸钠消毒液，退出实验室并贴出危险标识以示禁止入内。规定时间后，穿防护服并佩戴呼吸保护装置，将含1%有效氯的次氯酸钠消毒液的布和纸巾及打碎的器皿用镊子夹取玻璃碎片，放入锐器盒内进行高压处理。如果实验表格或其他打印文字材料或手写材料被污染，应把这些材料内容抄到另一表格上，并把原件放到盛有1%有效氯的次氯酸钠消毒液的容器内。在生物安全员的监督下进行空间消毒净化。暴露人员应进行医学观察。

当生物安全柜故障或意外停电停止工作后应中止操作，封闭所有盛装感染性物质的容器，关闭生物安全柜玻璃窗。向监控室报告情况，并报告相关负责人。然后按标准程序退出实验室或从应急门撤出。当实验室恢复工作后，排除各种安全风险后可重新进入实验室进行实验操作。

当在实验室内有操作人员突然晕倒时，另一名操作人员应停止工作，并更换一副新手套，向监控室报告，请求人员进入第二缓冲间做好准备工作，外部人员做好救助准备。将晕倒的人员扶到坐的姿势，让晕倒人员的背和头靠在救护者的胸前，救护者的双手和胳膊架在晕倒的人的腋下，在保证无障碍的情况下，将晕倒的人拖到第二缓冲间，脱掉防护眼罩、口罩，尽可能脱掉晕倒人员和自己的防护服。外边进入人员帮助将晕倒的人搬出实验室。

2.2.4 废物的处置 实验室产生的有潜在生物危险的废物必须在实验室内消毒灭菌，无害化后方可移出实验室。废物处置实验操作的主要危险因素有：设备的示值有误、指示剂的示值有误、灭菌设备泄漏气体或液体、生物密封失效等。

实验产生的感染性废弃物应放入密封袋，再放入医疗垃圾袋，扎牢袋口，置高压灭菌装置中121 ℃高压灭菌20 min，高压灭菌后在焚烧区集中焚烧处理。

3 小结

高等级生物安全实验室是国家生物安全核心基础设施之一，美国和英国等西方发达国家早在20世纪早期就分别建立了BSL-4实验室，此后，俄罗斯、德国、法国、澳大利亚、加拿大、意大利、瑞典、荷兰以及亚洲日本、韩国、印度和我国台湾地区都相继建设BSL-4实验室并开展烈性传染病和高危险度病原微生物的科学研究。目前如世界卫生组织、国际标准化组织等多个国际性组织和多数发达国家均已形成了比较完整的高等级病原微生物实验室生物安全法规标准化体系，特别是美国、加拿大、英国等欧美发达国家在病原微生物实验室安全的法制化建设上具备丰富的经验。WHO制定的《实验室生物安全手册》分别对高等级实验室的建设标准、认证认可，实验室生物安全的规范化管理，实验室个人防护装备、关键设备设施等“硬件条件”和标准化操作规程(SOP)、安全监管条例、实验室人员制度化培训等“软件措施”等做出十分明确具体的要求。此外，美国CDC/NIH《微生物和生物医学实验室生物安全手册》(BMBL)则是结合现代病原微生物实验室的特点和管理要求，对WHO《实验室生物安全手册》的相关内容做进一步的细化和升华，上述分别代表国际组织和发达国家的两类实验室生物安全领域的法律法规已成为国际同行学习、借鉴和参照的“金标准”。

我国自2004年《国家高级别生物安全实验室建设规划》发布以来，已经形成了高级别生物安全实验室体系的基本框架。为进一步提高我国高级别生物安全实验室体系的建设水平，增强生物安全科技自主创新能力，根据《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《国务院关于加强传染病防治人员安全防护的意见》有关要求，国家发展改革委和科技部于2016年制定并印发了《高级别生物安全实验室体系建设规划(2016-2025年)》，提出到2025年形成布局合理、网络运行的高级别生物安全实验室国家体系的发展目标，要求完善实验室保障条件，健全实验室管理体系，加强对实验室生物安全防护的质量控制和全过程监管，完善实验室生物安全、菌(毒)种保藏、储存、运输相关规范和操作流程，落实安保设置措施，制定实验室生物安全事故应对和处置预案。

为了建立完善高致病性动物病原微生物实验操作相关过程的风险因素的识别和评估体系，课题组按照高等级生物安全实验室风险管理的要求，针对高致病性病原微生物的危害和生物学特性，选取世界动物卫生组织(OIE)和我国农业部都将其列为生物安全4级的亨德拉病毒作为高致病性病原微生物的研究对象。虽然目前国内外暂无我国亨德拉病毒自然感染的病例报道，但亨德拉病毒的自然宿主是果蝠，中间易感宿主主要是马，而果蝠在我国西部地区广泛分布，我国西部某些地区(如新疆伊犁地区)又恰是我国最大的马匹饲养基地，因此具备了亨德拉病毒传播的必要条件。马匹可因带毒果蝠分泌物污染牧草或者食用果蝠嚼过的剩余果肉而感染，人又因和马匹的密切接触而感染。“丝绸之路”沿线日益广泛的商业交流也增加了亨德拉病毒传入的风险，一旦出现亨德拉病毒感染，我国必将开展有针对性的实验活动。但国内尚缺乏亨德拉病毒实验活动中的安全风险评估资料，盲目地开展实验活动只会加剧病毒的扩散，因此有必要根据高致病性动物病原微生物实验操作的特殊性和实际情况，以《实验室生物安全通用要求》(GB 19489—2008) 及其他相关法律、法规为基准，结合WHO制定的《实验室生物安全手册》及美国CDC/NIH《微生物和生物医学实验室生物安全手册》(BMBL)两项“金标准”的相关指导，对亨德拉病毒感染性因子的特性、实验过程中的生物安全防护、意外安全风险等要素进行风险评估，并提出防控措施。

进行风险评估主要包括鉴定感染因子的危害、鉴定微生物实验操作过程中的危害、实验活动人员评估、设施设备和环境评估、根据风险评估制定防范措施、组织专业人员审查风险评估等步骤。本次研究仅以亨德拉病毒为模型，评估了感染性因子的特性及实验过程中的风险识别与控制。下一步，课题组还需要对实验室人员、实验操作废弃物消毒处理、实验室安保等项目进行风险识别与评估，并对目前全球范围内高等级生物安全实验室事故进行分析，对暴露的和潜在的风险点进行系统梳理，积极推进高等级实验室生物安全风险评估工作的开展，为撰写风险评估报告积累素材。