调节瘤胃实现粗饲料的高效利用

王佳

（浙江大学奶业科学研究所，浙江杭州 310058 ）

饲草是反刍动物产业发展的物质基础。我国饲草资源短缺，进口饲草量逐年增加，但我国农业副产物资源十分丰富，具有饲料化利用的巨大潜力。农作物秸秆存在消化性差、可利用养分不足等缺陷。为了提高秸秆饲料化利用效率，学术界和产业界经历了化学[1]、高压蒸汽[2-3]、膨化[4]、酶和微生物预处理[5]等加工手段的研究，营养补饲[6]、外源酶[7]、微生物添加剂[8]的研发以及作物遗传选育[9]的探索等。虽然上述方法在不同程度上提高了秸秆的利用效率，变废为宝，但在生产应用中仍不能满足易操作、环境友好和效果稳定等要求。因此，针对秸秆消化性差这一特性，有必要进一步提升预处理酶和饲用酶的效价，避免饲用酶被瘤胃微生物降解。

瘤胃是纤维物质降解的主要场所，功能强大的瘤胃意味着生产效率的最大化。瘤胃的早期发育直接影响反刍动物成年后的泌乳[10]和产肉性能[11]。幼龄期尤其是断奶前期是瘤胃最可塑的阶段，饲料组成及形态、挥发性脂肪酸、瘤胃的pH值以及瘤胃微生物等，这些因素相互作用、相互牵制，共同影响瘤胃的形态和功能分化。为此，从动物内源因素出发，通过营养供应、物理刺激等多角度调节幼龄反刍动物瘤胃发育，提高瘤胃微生物消化能力及瘤胃上皮的吸收功能，应该是提升粗饲料利用率的另一突破口。

为此本实验室开展了高效纤维分解酶基因挖掘、酶菌一体化产品开发和瘤胃发育调节3方面的研究，以期通过提升外源酶效价改善反刍动物的秸秆消化率，调节瘤胃早期功能分化培育反刍动物的秸秆利用潜力。

1 高效纤维分解酶基因挖掘

消化道微生物生态群落是一个非常复杂的生物体系，有着巨大的基因资源以及丰富的生态资源。宏基因组学和宏转录组学通过免培养技术，分别研究生境中全部微小生物遗传物质的总和与全基因组的转录情况以及转录调控规律，在研究消化道微生物代谢和开发消化道微生物资源上展示出强劲的优势[12-13]。蛋白质工程技术，包含蛋白质的理性设计和非理性设计2种方法。传统的理性设计需要预先知道蛋白质的结构、活性位点、催化机制等信息，在清楚结构与功能的前提下，定点突变改变蛋白质分子中个别氨基酸残基，产生新性状的蛋白质。然而，在实际应用中，蛋白质的结构信息很难获取，结构与功能的关系异常复杂，因此理性设计具有很大的限制性。蛋白质的非理性设计，即体外定向改良，它模拟达尔文的自然进化论，利用基因的突变和重组，在体外改造酶的基因，产生基因多样性，并结合定向的筛选最终获得预期性状的进化酶[14]。因此，我们利用宏基因组学和宏转录组学技术，从草食动物消化道微生物中筛选具活性的酶基因，并通过定向改良技术进一步提升酶的特性。

通过扩增草食动物（奶牛、水牛、湖羊、麋鹿、马和兔子）消化道微生物的糖苷水解酶家族（GH）10和11的基因发现，湖羊纤维分解菌中真菌所占比例高于其他物种[15]。为此确定湖羊为目标物种，成功构建了湖羊瘤胃微生物Fosmid文库，筛选到木聚糖酶阳性克隆16个，内切葡聚糖酶阳性克隆18个[16]。其中两个木聚糖酶基因ORF6-UN[17]和Xyn-LXY[18]经大肠杆菌表达后酶活性分别达到1 150 U/g和664.7 U/g，且这两个木聚糖酶可以水解木聚糖产出高量的木二糖，具有消化道益生作用。通过随机突变和定向筛选使ORF6-UN比活和催化速度分别提升2倍和4.6倍[19]。

通过湖羊瘤胃微生物宏转录组预测到249个具有纤维素酶催化模块的开放阅读框。其中β-1, 4-内切葡聚糖酶主要存在于GH5、GH9、GH44和GH45家族，外切葡聚糖酶主要存在于GH48家族，而β-葡萄糖苷酶主要存在于GH1和GH3家族中。经部分检测，宏转录组获得的酶基因具有更好的内切葡聚糖酶活性。

2 酶菌一体化开发

酶作为一种外源蛋白，动物采食后极易被瘤胃中的微生物降解。然而瘤胃中存在的微生物不仅存活着，而且发挥着重要的功能，为此考虑是否可通过微生物承载外源酶，通过微生物的保护使表达的酶逃避瘤胃微生物的降解，并通过微生物的增殖，保持该酶在瘤胃中的浓度。为了实现这一目标就需要合适的载体菌以及酶菌一体化的方式。酵母及其培养物对瘤胃的益生作用已得到广泛证实，而且酵母细胞表达体系具备较为完善的蛋白质翻译后修饰和分泌的机制。以酵母为基础的细胞表面展示技术是一项新兴的真核蛋白展示技术，其基本原理是将外源靶蛋白基因与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞，融合蛋白诱导表达后，信号肽引导融合蛋白向细胞外分泌。由于融合蛋白含有锚定酵母细胞壁的结构，可将融合蛋白锚定在酵母细胞壁中，从而将外源蛋白分子固定化表达在酵母细胞表面。该技术已成功应用于蛋白质识别、蛋白质的固定化和定向进化研究，成为了蛋白质工程研究的重要工具[20]。因此我们选择酵母表面展示技术表达ORF6-UN，生产全细胞的酵母酶，以期发挥酵母和酶的双重功效。

经酵母细胞表面展示，实现了每克冷冻后的细胞表面木聚糖酶酶活为137 U。体外产气试验证实该酵母酶可有效提高玉米秸秆的干物质降解率，缩短产气延滞时间，增加挥发性脂肪酸和微生物蛋白产量，且其作用效果显著优于酵母本身，实现了酵母和酶的双重功效[21]。

代谢组分析显示该酵母酶通过促进瘤胃中微生物的苯丙氨酸代谢等发挥功能。即外源酶通过内源微生物的介导而发挥提高纤维物质降解的作用。这也进一步说明瘤胃早期功能调节的重要性[22]。

3 瘤胃功能分化的调节

精料的饲喂可以在瘤胃内生成更多的挥发性脂肪酸，尤其是丁酸和丙酸，这些挥发性脂肪酸可促进瘤胃上皮的快速发育[23]。然而有研究显示，精料的饲喂易使瘤胃上皮粘附食糜斑块[24]。在饲喂精料的过程中补饲粗料可以提高日增重、胴体重和瘤胃健康水平[25]，补饲粗料的效果受粗料类型、纤维长度以及补饲量的影响[26]。我们以湖羊为研究对象，研究了粗饲料的早期补饲对幼龄反刍动物瘤胃发育的影响。饲养试验结果显示，羔羊出生后10 d补饲苜蓿能够提高断奶前后开食料和粉状精料的采食量和营养物质摄入量，增加幼龄反刍动物的体重、日增重、胴体重，促进前胃和脏器的发育，减少瘤胃壁食糜粘附[27]。

为了研究这一过程中瘤胃微生物如何快速适应饲料的改变，瘤胃上皮又如何回应微生物及其代谢产物的变化，我们在饲养试验的基础上，系统地比较了补饲苜蓿与否对瘤胃微生物区系和瘤胃上皮基因表达的影响。研究发现，羔羊出生后10 d补饲苜蓿能诱导瘤胃微生物区系在断奶前就部分接近断奶后，减少断奶前后细菌属水平的变化，提高微生物区系的稳定性，从而促进羔羊对断奶后高纤维日粮的适应性，减少断奶应激。补饲苜蓿在断奶前增强细胞代谢过程、细胞定位、生物质量调控等分子功能；瘤胃上皮中细胞色素P450、类固醇激素的生物合成、脂肪酸代谢等代谢途径，从而在断奶后代谢途径和生物过程相对稳定。而不补饲苜蓿的羔羊在断奶后再接触苜蓿则表现为应激反应、生物质量调控、外源刺激反应、化学反应等分子功能和紧密连接蛋白、唾液分泌等代谢途径的增强[28]。

4 小结与展望

组学与定向进化及酶菌一体化技术的联用，使外源酶的开发和应用更为高效；瘤胃早期功能调节使粗饲料的高效利用有了新的靶点。然而酶结构，如纤维小体（Cellulosomes）和多糖利用基因座（Polysaccharide Utilization Loci），与功能的关系；瘤胃功能调节的作用机制和长效性等都有待深入研究。

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