家兔转录组的研究进展

张翔宇，谢晓红，黄邓萍

（四川省畜牧科学研究院，动物遗传育种四川省重点实验室，四川成都 610066）

家兔是节粮型食草小动物，是重要的肉类和皮毛来源之一，也是许多人类疾病研究的理想动物模型。兔肉具有高蛋白、高卵磷脂、高氨基酸和低胆固醇的特性，是许多慢性病患者（肥胖、心脑血管病、糖尿病）的理想肉类来源，因此家兔在畜牧业和科学研究中占据着十分独特的地位[1]。肌肉和皮毛发育对家兔各生长阶段的体重、产肉性能、肉质、兔皮品质均有重要影响，与之相关的重要功能基因研究一直是家兔科研领域的热点。家兔的肌肉和皮毛发育是一个涉及多基因表达、多信号通路及多调控网络的复杂过程。随着miRNA的发现和功能研究的深入，大量证据表明，基因组中非蛋白质编码区的miRNA与靶mRNA共同参与了个体的许多重要生理过程[2]。miRNA调控主要是通过与靶基因的mRNA互补结合后形成双链RNA，进而诱导沉默复合物降解mRNA或抑制其翻译过程[3]。同时，作为一类新的调控因子，miRNA在细胞增殖分化和凋亡、个体的生长和发育中起了重要的调节作用[4]。因此，阐明miRNA及其靶mRNA的调控网络在生长和发育过程中的作用机制显得尤为重要。本文对家兔转录组的研究进展，尤其是转录本对家兔肌肉和皮毛发育、繁殖生理及免疫调控进行了综述，以期为家兔的遗传改良和人类疾病的研究提供参考。

1 家兔转录组鉴定的高通量测序技术

转录组是指处于特定发育阶段或具有特定功能的组织（细胞）转录过程中产生的所有RNA的总和，包括信使RNA、核糖RNA、转运RNA和非编码RNA[5]。转录组的相关研究主要通过对不同发育阶段、不同生理状态和不同环境条件下不同类型转录本的表达量分析，发现与生物学过程密切相关的差异表达转录本，这些差异表达的转录本是进一步进行生物学功能和作用机理研究的重要前提[6-7]。根据原理的不同，转录组的主要研究技术包括基于杂交原理的芯片技术、基于测序原理的RNA-seq测序技术和基于PCR原理的实时荧光定量技术。家兔全基因组测序的完成不仅为许多驯化相关的遗传学问题提供了答案，也为家兔转录组学研究的深入提供了必要条件[8]。以Sanger测序为原理的SAGE技术和MSPP技术不需要相关基因组信息，具有自动化程度高、通量较大的优点。但传统的Sanger测序操作复杂、效率低、测序深度有限，严重制约了动物新转录本的发现速度。令人欣慰的是，基于第二代测序的RNA-seq具有检测速度快、成本低、覆盖深度广、信息量大等特点，特别适合小分子RNA测序；同时，RNA-seq技术解决了低丰度和组织特异表达转录子难于鉴定的技术问题，通过对测定的序列进行计数，以准确获得每个特定转录本的表达量。罗氏454公司的GS FLX测序平台、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer测序平台和ABI公司的SOLiD测序平台是使用较为普遍的RNA-seq测序技术平台。Solexa技术采用“边合成边测序（Sequencing-By-Synthesis，SBS）”的原理，一次性可以得到最大约10亿个碱基序列，足以分析单个样本中所有转录本的详细信息，GS FLX较SOLiD技术拥有更高的通量和更低的成本。然而，物种的基因组注释信息太少将严重影响高通量测序发现新miRNA的准确性和数据挖掘的深度，极大地限制RNA-seq测序技术在相关转录组研究中的应用。Li等[9]利用SOLiD和Solexa高通量测序平台对家兔大脑和心脏的miRNA进行了检测，共检测到了464个miRNA前体和886个成熟的miRNA，部分miRNA及其同形异构体在大脑和心脏的表达上存在差异。牛晓艳等[10]采用Illumina平台对白色和海狸色獭兔皮肤组织中mRNA进行高通量测序，共发现12 408个差异表达基因，其中8个差异基因位于细胞色素代谢通路中。CP2F1、CP2BB和GSTA4可能对獭兔毛色的形成起调控作用。周太成等[11]采用RNA-seq测序技术对高原鼠兔进行低海拔驯养过程中转录组的变化进行了分析，结果发现与脂肪代谢、抗紫外线辐射和酒精代谢相关基因表达量降低，而与免疫适应和抗电离辐射相关基因表达量升高。基因表达谱芯片技术主要基于核酸杂交配对的原理，利用经不同荧光分子标记的处理组和对照组的mRNA分别与芯片进行杂交，再计算杂交荧光信号的比值来确定mRNA的表达量。基因表达谱芯片可以对不同个体、组织、生理过程、发育阶段下细胞内的mRNA或逆转录产物cDNA的表达量进行检测，具有准确、快速和高效的特点，一次能检测上万个基因的表达量，几乎覆盖该物种的所有基因[12]。但基因表达谱芯片技术的分析价格较为昂贵，同时还受到基因组信息完整程度的限制。李冰等[13]利用家兔全基因组表达芯片对4日龄不同被毛密度獭兔皮肤组织进行了差异基因筛选，筛选出188个差异表达基因，其中IGF-1 、VEGF和BMP-2可能与獭兔被毛的形成有关，Wnt和PPAR信号通路可能参与獭兔被毛发育。孙露露等[14]采用家兔全基因组芯片对被毛长度和密度存在显著差异的皖系长毛兔和新西兰白兔皮肤组织中的转录组进行了差异表达分析，结果发现Wnt10b、Shh、SFRP2基因可能在家兔毛纤维的生长发育中起重要作用。段红梅等[15]利用全基因组芯片对胚胎期和出生后家兔皮肤创伤后愈合组织的基因表达量进行了检测，共发现差异表达基因113个，推测这些基因可能参与胎儿及成人皮肤瘢痕愈合的形成过程。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术通过在PCR反应体系中加入荧光染料，以实现对PCR全程的监测。通过对每次循环产物荧光信号的实时收集来实现对起始模板定量和定性的分析，该技术可在实验结束后立即得到定量结果，无需凝胶电泳分析和其他实验操作，具有操作简单、结果可靠的特点，逐渐成为对转录组进行定量分析的常用方法[16]。但qRT-PCR一次检测的转录本数量较少，覆盖度较低。吴添文等[17]采用实时荧光定量技术对福建黄兔、德系长毛兔和美系獭兔不同部位皮肤组织中的KAP3.1、KAP3.3、KAP6.1和FGF5等基因的表达规律进行了研究，结果表明这些基因的表达存在品种和部位的差异。随着技术不断发展和对实验结果准确性的要求不断提高，出现了新的检测技术和实验策略。cDNARFLP将RT-PCR和AFLP技术相结合，通过对cDNA限制性酶切片段进行选择性扩增最终形成RNA指纹图谱，极大地提高了实验的准确性和重复性。另外，随着基因芯片和RNA-seq成本的逐渐降低，采用2种及以上技术进行联合分析也成为转录组研究的新趋势。

2 肌肉发育相关的转录组

肌肉的生长发育不仅影响家兔产肉量，还影响着肉质、机体的能量和蛋白质代谢[18]。肌肉发育是一个复杂的生物学过程，涉及骨骼肌干细胞和成肌细胞的增殖和分化。转录本（mRNA和miRNA）几乎参与了肌肉发育的所有环节，在肌肉发育过程中起重要的调控作用。目前研究表明，多个基因参与了家兔肌肉的生长发育并影响肌肉的功能。Wang等[19]以生长速度和肉质存在显著差异的新西兰白兔和福建黄兔为研究对象，利用基因芯片技术筛选到7个与肌肉发育关联的差异表达基因（Myh6、Myh7、Myh7b、Myo5b、Tnnc1、Tpm3、Acta2），并发现Tpm3和Myh7基因在背肌中的表达水平高于腿肌，可能存在协同作用。王文洲等[20]利用qRT-PCR技术分析发现，Myh6基因在福建黄兔和新西兰白兔背肌和腿肌中的表达量都是先增加后降低最后趋于稳定，在新西兰白兔中的表达量高于福建黄兔，这与肌纤维面积、长径和短径的变化一致。因此，推测Myh6基因可能促进肌纤维的发育。另外，SPF环境下新西兰兔的后腿MyoG基因表达量显著高于普通环境组，这与后腿重量差异结果一致，因此MyoG基因除参与调节体外肌细胞分化外还可能调控家兔后腿的肌肉发育[21]。吴周林等[22]对兔骨骼肌卫星细胞中MSTN和Ankrd2基因的表达进行了抑制，结果发现肌管分化能力增强，推测MSTN和Ankrd2基因对肌管分化有抑制作用。miRNA-1/206具有高度的同源性，功能也十分相似。miRNA-1/206通过作用于靶基因Pax7和Notch3，能促进骨骼肌卫星细胞分化为成熟的肌细胞[23]。在骨骼肌再生和肌细胞融合过程中，miR-1通过与mTOR通路的相互作用实现对该过程的调控。miR-1基因通过与氧化磷酸化相关基因Cox1和ND1相互作用，加强细胞线粒体的能量代谢水平[24]。miRNA-206能与多个靶基因（如Id1-3、MyoR、BDNF、Hmyb3、RUNX1、ZNF238 和Cx43等）作用促进骨骼肌细胞的分化和发育，还能作用于Hdac4基因，促进骨骼肌卫星细胞的增殖，其表达量与卫星细胞的活化程度相关[25]。miR-27能够通过与靶基因的作用抑制肌源性祖细胞增殖、迁移，促进分化，miR-27过表达时会减缓小鼠肌肉损伤的修复，缩减新生肌纤维的直径[26]。

3 毛皮发育相关的转录组

皮肤的发育不仅影响兔皮的面积，皮肤表皮中的毛囊还影响着兔毛的密度和品质，一定程度上还参与了兔毛色的形成。研究兔毛皮的生长发育不仅有助于提高兔皮的质量，还有助于人类脱发、白癜风等疾病的研究。研究表明，许多转录本参与了动物皮肤、毛囊的周期性发育和色素沉积，通过调控相关的信号通路，影响皮张的面积和毛色的变化[27]。陈赛娟等[28]利用基因芯片技术，检测了被毛密度存在差异的獭兔皮肤组织的差异表达基因，结果筛选出了2 657个在皮肤组织中差异表达的基因。经注释后，这些基因大多与细胞增殖、分化、凋亡、细胞信号转导等有关，其中，MP2、TGFβl、TGFβ2、IGF-1B 、BMP2、ActRCCNA2基因可能对皮肤毛囊的发育起重要调控作用，最终造成獭兔被毛密度的差异。Zhao等[29]采用RNA-seq技术对青紫兰色獭兔的背部和腹部皮肤组织的转录组进行分析，发现共有336个基因差异表达，主要富集于与皮毛发育密切相关的 WnMAPK信号通路，SFRP2、FRZB、CACNG1、SLC25A4和SLC16A3可作为皮毛发育的重要候选基因。Pan等[30]以皱襞型和非皱襞型白色獭兔为研究对象，皱襞型白色獭兔因其腹部、四肢及其臀部会出现一些皱褶，皮张面积较普通型大15%，采用RNASeq技术以皮肤为样本进行测序分析，共检测到308个差异表达的基因，其中与家兔皮肤发育密切相关的基因（MYL12B、LAMB3、PLON、EIF3E、CEBPA、FADS2、ENPP6），可能是调控獭兔皱襞的关键因子。为了揭示獭兔毛色的遗传机制，Qin等[31]对3种不同毛色的全同胞獭兔（黑色、青紫蓝色和白色）的皮肤组织的转录组进行高通量测序，共检测到257个差异表达的基因，其中TYRP1、TYR、Oca2、Dct和Slc7a11基因可能在獭兔毛色形成过程中起重要作用。秦立志等[32]利用表达谱芯片技术对全同胞青紫蓝色獭兔和白色獭兔背部皮肤组织中的差异表达基因进行了检测，共发现89个差异表达的基因，其中Crebl、TH、Wnt2、Gnaq、Dvl1、Mapk12等基因可能参与獭兔毛色形成。王晓明等[33]对福建黄兔和新西兰白兔杂交F1代不同发育阶段的MC1R表达量进行了分析，发现4～10周龄表达量持续上升，10～12周龄表达量出现了短暂的下降。上述研究表明，不同表型和生理状态的皮肤组织中mRNA的表达在数量和种类存在差异，差异表达的基因可能对皮毛发育过程中的特定生理过程有重要的调控作用。miRNA对动物皮肤、毛囊的发育及色素沉积起着重要的调控作用，MiR-199和MiR-200家族在皮肤和毛囊中差异表达，Oar-miR-320、Oar-miR-103和Oar-miR-148可能通过Wnt信号通路来控制羊毛生长，MiR-205可以调控PIK3信号通路，促进早期毛囊干细胞的增殖，对毛囊形态具有重要的作用[34-35]。MiR-125b能作用于靶基因维生素D受体，影响干细胞的分化能力，其异常表达会引起脱毛[36]。MiR-137、MiR-182、MiR-25和MiR-218通过作用于小眼畸形转录因子（MITF），调控酪氨酸酶及其相关蛋白，影响机体黑色素生成[37]。

4 繁殖相关的转录组

卵巢和子宫是重要的生殖器官，转录组在家兔卵巢和子宫发育过程中起着重要的调控作用，通过复杂的信号通路直接参与受精、植入和妊娠等生理过程。冯雪等[38]以低产加利福尼亚兔和高产哈尔滨白兔为研究对象，构建了高产组和低产组文库，经高通量测序后，共筛选到321个差异表达的mRNA，其中FSHR、BMP6、BMPl5、INHBB和HSD17B1基因与兔繁殖力相关最紧密。Ballester等[39]采用抑制性消减杂交的方法对2个子宫容量存在差异的肉兔品系进行了基因差异表达研究，发现了47个与胚胎着床和发育相关的差异表达基因，其中PGR、HSD17B4和ERO1L基因在子宫容量较小的品系中过量表达。另一项研究表明，TIMP-1基因在子宫容量存在差异的2个品系家兔输卵管中的表达量存在显著差异[40]。Saenz-de-Juano等[41]利用实时荧光定量对体内和体外发育的兔囊胚期胚胎的OCT4、VEGF和erbB3的mRNA进行了表达差异分析，发现OCT4基因的表达量在不同的发育环境中存在显著差异，推测OCT4基因可能影响家兔胚胎的囊胚期发育。Baranda-Avila等[42]利用qRT-PCR 技术对怀孕早期的家兔输卵管不同部位的ESR基因表达量进行了检测，与未怀孕母兔相比，怀孕母兔输卵管不同部位的表达量均显著升高，但壶部和峡部的表达方式存在差异，可能与其功能差异有关。随着对miRNA研究的深入，其在调控卵巢生理方面的作用逐渐引起研究人员的关注。定向敲除Dicer的雌性小鼠均出现了不同程度的生殖缺陷，而Dicer酶为miRNA成熟过程中必须的酶。因此推测miRNA在生殖过程中发挥重要作用[43]。雌激素和孕酮可以调控基质细胞中miR-20a、miR-26a和miR-21的表达以发挥其在繁殖过程中的功能[44]。miR-18a、miR-29a和miR-199在子宫、卵巢、输卵管及黄体等组织中大量表达，但其作用机理有待进一步研究[45]。

5 疾病相关的转录组

Kwon等[46]首次建立了兔软骨组织的EST文库，用于软骨相关遗传机理的研究，结果发现COL2A1和COL10A1 在兔的软骨组织中高表达，而PRG4、DCN和COMP的表达量随兔龄的不同而存在差异。陈仕毅等[47]对患肠炎病兔与正常兔的MyD88的mRNA表达量进行了比较，发现MyD88 mRNA的表达量随个体易感性的增加而增加，并且抗感染能力最强的CC基因型个体的mRNA表达量最低。家兔是研究高脂血症等人类疾病的重要实验动物。Zhen等[48]研究了3种实验室应用最广泛的家兔品种（新西兰白兔、日本大白兔和遗传性WHHL兔）的全基因组变异，并对WHHL和高能量饲喂的新西兰白兔的不同器官进行转录组测序，结果发现2种家兔的主动脉的基因表达方式基本一致，高能量饲养组肝脏出现了明显的炎症反应和异常的脂代谢。研究结果为鉴定动物模型高脂血症的治疗标靶提供参考。王萧等[49]运用导管术造成新西兰白兔主动脉瓣膜关闭不全建立心衰模型，并利用基因芯片技术分析该模型基因表达差异，共检测出665个差异表达基因，主要与离子通道、肌收缩和信号转导等功能有关。绿脓杆菌是引起伤口感染的一种常见细菌。Karna等[50]建立了兔耳外切伤模型，对感染后的家兔进行了转录组测序，结果发感染后到感染后第3天miRNA迅速下调，随着感染的加剧miRNA开始上调，而皮肤发育相关的编码基因表达量降低。大量的mRNA和miRNA可能参与到伤口从感染到康复的整个过程。免疫系统是机体对抗疾病的重要屏障。大量的研究结果表明，miRNA在机体固有性免疫应答、获得性免疫应答、T/B淋巴细胞的分化、病原体感染与免疫及炎性等重要免疫过程中起重要作用[51]。miR-155是维持正常的免疫功能必须的转录因子，还能调控炎症反应。miR-155通过抑制靶基因的表达参与机体对LPS的负反馈调控[52]。miR-150参与了T、B细胞的发育成熟，并且与Foxp3存在关联[53]。miR-16则通过参与调控细胞周期调控机体的免疫过程[54]。

6 结 语

综上所述，家兔转录组学主要从整体水平上研究细胞中转录本的表达情况和转录调控规律，是家兔生物学的重要分支。目前已经利用基因芯片、RNA-seq和荧光定量等技术对家兔不同品种、发育阶段和生理状态进行了转录组分析。对繁殖性状、生长性状、毛皮发育和疾病相关性状的研究发现了许多对家兔重要经济性状有影响的生物学通路，筛选出了大量参与肌肉和毛皮发育并具有重要生物学意义的潜在功能基因。

在后续的转录组相关研究中，一方面应当充分利用转录组测序技术挖掘更多的具有重要生物学功能的转录本（mRNA和miRNA），另一方面应当加强筛选对生理过程和发育周期可能有重要作用的转录本的表达谱分析和功能研究。综合利用转染、基因敲除和荧光素酶报告检测等技术从细胞水平上验证候选转录本的功能，并开展转录机制的研究，在此基础上筛选出能应用于育种实践的分子标记。最终实现家兔生产性能的整体提升，并为人类许多代谢疾病、慢性病的治疗提供参考。