猪链球菌荧光定量PCR检测方法的建立及临床应用分析

（北京纳百生物科技有限公司，北京 100176）

猪链球菌为对公共卫生安全构成严重威胁一种典型人兽共患病原菌，可引发支气管肺炎、猪脑膜炎、败血症等多种疾病，如何防控是相关部门研究的重点。在对猪链球菌进行检测时，生化鉴定、细菌培养均为常用手段，但除检测用时较长外，且极易出现漏诊或误诊事件，准确度居较低水平[1]。而荧光定量（PCR）特异性、灵敏性均较理想，可有效规避上述检测方式的不足，为疾病控制提供有力参考依据。本次研究以此展开探讨，现结果如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

（1）仪器与试剂：DU640型核酸蛋白仪、PCR仪均购自美国ABI公司；Premix Ex TaqTM试剂盒由Takara公司提供。（2）菌株：猪生活区域分布的常见菌群，包括丹毒杆菌、猪副溶血嗜血杆菌、猪布鲁氏菌等；猪链球菌。

1.2 探针序列

参考猪链球菌在GenBank中已呈登录状态的抗原基因序列，对基因保守区展开细致的分析；在Primer Express 3.0软件中，对极具特异性的探针及引物设计，并经BLAST，初步鉴定其特异性，合成一对特异性引物和探针。

1.3 制备阳性标准品

含部分含有猪链球菌抗原基因的片端于PUC57质粒上构建，对重组克隆菌予以制备，以在后续的扩增实验使用。对重组质料有效提取后，在紫外分光光度计辅助下，获取OD260和OD280值及两个数值比值，检测3次，获取平均值，对质粒DNA所反映的纯度、浓度确定，准确计算拷贝数，按1×105拷贝/ μl稀释，于-20℃条件下冻存备用。质粒具体的检测浓度×6.02×1023与质粒总长度×600的比值为拷贝数。

1.4 样品检测及提取DNA

对15只疑似猪链球菌感染的猪扁桃体组织采集，于无菌条件下，精密称取1g，在研钵中放置，取生理盐水2.5ml加入，行研磨及充分混匀处理，取研磨液150μl，应用DNA提取试剂盒，有效完成对基因组DNA的提取工作，模板DNA的纯度、浓度应用紫外分光光度计测定，DNA样品获取后，于-20℃条件下冻存备用。

1.5 建立荧光定量PCR体系

在PCR仪上完成PCR扩增反应，程序：设置温度为42℃，用时为20min；设置温度为95℃，用时为10min，设置温度为94°C，用时为15s，设置温度为55℃，用时30s，共有循环40个。依据此程序，以阳性质粒为实验模板，分别优化退火温度，即52℃～60℃；探针浓度，即2.5～7.5μmol/L；引物浓度，即5～10μmol/L。以2μmol/L对探针浓度做递增处理，以2°C对退火温度作递增处理，对PCR反应条件予以优化。

1.6 检测灵敏性

将猪链球菌重组质粒向1×105拷贝/μl稀释，再于10倍系列条件下，对5个梯度稀释，模板为1×101-1×104拷贝/μl，单个梯度安排3次操作，对其灵敏度进行测定。1.7 检测特异性

应用优化后方法，对丹毒杆菌、猪链球菌、猪布鲁氏菌、猪副溶血嗜血杆菌加以检测，设置空白对照及阴阳性对照，以对特异性开展验证。

1.8 临床实验

取15只疑似猪链球菌感染的病猪扁桃体组织总DNA，空白对照为ddH2O，阳性对照为猪链球菌重组质粒，阴性对照为健康猪相同组织总DNA，依据优化条件，完成FQ-PCR扩增操作，采用国标法复验，以对符合率验证。

1.9 统计学分析

涉及数据均输入spss13.0，组间计数资料采用（%）表示，行x2检验，P<0.05具统计学差异。

2 结果

PCR检测扩增曲线呈S型、Ct值<35为阳性，应用所建立的FQPCR法对灵敏度进行检测，最低限度为1×102拷贝/μl的重组质粒；特异性检测表明，仅猪链球菌样本有的扩增曲线，其他非目的模板均无扩增曲线；应用此种方法，检测15份疑似猪链球菌感染组织样本，阳性共14份，相较国标法检测，有更高符合率。见表1。

3 讨论

本次研究通过FQ-PCR方法的建立，进行猪链球菌荧光定量检测，取得了理想成效。同普通PCR相比，荧光定量PCR技术具有便捷、快速、敏感特异性高等特点，已在畜禽疫病诊断中得到广泛应用。此次采取探针与引物结合的方法，表现出了较高特异性，采用此方法检测其他细菌，仅猪链球菌有扩增曲线表现出，对其灵敏性进一步证实，能检测到1×102拷贝/μl的重组质粒，提示敏感性较理想[2]。应用此方法对15份疑似猪链球菌感染的组织检测，结果与细菌鉴定一致，且阳性率优于细菌鉴定，有较为理想的应用成效。

综上，针对猪链球菌，采用荧光PCR检测，有较高灵敏度及特异性，符合率居更高水平。

[1]李建达，于江，张玉玉，等.猪链球菌2型实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用[J].中国畜牧兽医，2016，43（12）：3107-3133.

[2]王蓉蓉，孙卫东，蒋蔚，等.猪链球菌2型主要毒力因子三重荧光定量PCR检测方法的建立[J].中国动物传染病学报，2014，22（6）：25-31.