兽用疫苗生产过程中正确检测和预防支原体污染的方法

余彬辉 余艳辉 贾布拖

（1.浙江易健生物制品有限公司，浙江绍兴 311800；2.杭州佑本生物制品有限公司，浙江杭州 310018）

随着我国兽医专业的不断发展，对于动物疾病的诊断技术水平也不断地提高，相关领域的技术人员对于支原体的认识也更加的深入，现在所知的自然界中存在的这类微生物已经远远超过了100种，根据国内外现有的报道可知这100余种的微生物都会通过直接或间接的方式对人类和动物造成疾病的感染。如果人或者动物感染支原体，会造成呼吸道出现感染、生长发育停滞并且会对免疫系统造成相应的损伤。此外，通过细胞培养生产生物制品也面临着比较难解决的情况，所以相关的兽医工作者对此给予了比较广泛的关注。

1 相关概述

支原体属于原核微生物，不具有细胞壁，个体微小，呈高度多态性，一般是通过常用的滤菌器，其毒株主要通过特殊的结构黏附于宿主细胞膜上，并与相应的受体结合，引起宿主细胞膜结构的改变及诱导宿主细胞产生某些细胞因子，从而导致宿主细胞的免疫反应表现出异常，最终可以引起各种疾病的发生。根据相关的试验结果可知：国内采用的普通疫苗和细胞生产活毒疫苗被支原体造成了比较严重的污染，这样对生物制药企业造成非常大的经济压力，同时也不利于畜禽疾病防恐工作的顺利开展。相关规定中注明所有细胞生产的活疫苗并不能检测到支原体的污染情况，所以就要求相关的技术人员掌握一定的对于支原体的检测技术，以保证生物制品生产工作得以比较顺利的开展和发展。

2 支原体的检测

2.1 传统检测法

直接培养法：我国的相关准则中明确规定，直接培养法是支原体检测的标准方法。具体主要是将待检样品接种到支原体培养基上，对液体培养基的颜色和固体培养基上支原体菌落的变化进行观察，然后通过正确的判断给出试验结果，这种方法的准确率比较高但是培养的时间却比较长，同一个培养基中所有的支原体类型并不能全部的检测出来，所以这种检测方法一般应用于种毒和成品的检测方面。

DNA荧光染色法：此种方法也被称为指示细胞法，此种检测方法的耗时比较短，并且能够同时对于多个样品进行检测，并且对于采用培养法不能检测出的支原体给予正确的检测，如果有条件在配制疫苗之前就进行初步的检测，将其中不合格的样品去除掉，这样能够避免相应的损失并且对疫苗的质量加以有效的保证。

2.2 血清学法

被动颗粒凝集试验（PPA）：可应用于细菌、支原体的鉴定和抗体的定性检测。我国相关的专家用此方式对肺炎支原体进行检测，结果可知被动凝集法的操作比较简单，但是却具有比较高的精确性和敏感度，在实际的临床生产中可以更有效的应用。

酶联免疫吸附试验（ELISA）：医学界至今为止，用此种方法是诊断人和动物肺炎支原体实用和可靠的方法之一。本检测方法操作简单并且特异性和敏感性都比较佳，目前已经被广泛应用于临床兽医学领域，并且成为检测肺炎支原体的在临床中的常规方法。

2.3 分子生物学技术

PCR检测技术：支原体通常生长都比较缓慢并且对于营养环境的要求相对比较高，并且在种间存在交叉抗原等生物学特性。随着相关领域研究人员逐渐深入对支原体的核酸结构、分子组成及其特异性的了解，国际上就已经在支原体的检测中融入了PCR技术，在特异性和灵敏性方面有更佳的表现，并且在兽用生物制品的生产中进行了广泛的推广和应用，但是此种方法对于试验环境和仪器的要求标准相对比较高，所以很容易出现交叉污染的情况，生产中必须给予足够的重视。

巢式PCR检测法：基于PCR检测方法加以优化改进，主要是通过设计巢式PCR引物的方式，根据扩增后是否存在目的片段的情况对具体的污染状况加以比较合理且正确的判断，然后根据存在片段的大小情况，对于污染的支原体类型进行正确的判断分析，从而将污染源进行准确的判断。

实时荧光定量PCR技术：根据相关的报道可知，最初是早在1996年的美国某家公司第一次推出了实时荧光定量PCR检测技术。现在，在动物营养与繁殖、动物遗传育种及动物疾病检测和预防等领域已经都有了实时荧光定量PCR技术的应用，但在实际应用中，在应用方面没有达到特别广泛的范围，从而受到了一定的限制，所以在实际的生产应用时应该给予一定的重视。

DNA分子杂交检查法：原核生物的rRNA是高度保守的。采用这种检测方法具有特异性高的特点，可大致的鉴别出污染支原体的种类。

3 相关防治措施

就目前所知的情况，自然界中有多于120种的支原体存在，实际在生物制品的生产过程中，感染支原体的组织细胞中会在不同程度上改变细胞形态和遗传物质，从而对病毒的复制过程产生一定的影响，同时会在不同程度上改变宿主细胞的免疫能力，从而诱导干扰素的产生。所以在兽用疫苗生产过程中，尤其是将培养细胞作为材料的疫苗生产情况，应该对于支原体的防治加以重视，决不能忽视。对于支原体的污染进行纠正的时候应该保持细胞营养液呈酸性，这样对于抑制支原体的生长是比较有效的条件。目前我国从事兽用疫苗生产研究的技术人员在参与生产生物制品的研制生产过程当中，以检测支原体的存在，以及鉴定支原体的种类是该手段实施的主要目的，也就是生产中所说的检测细胞的污染源，从而力争将其切断，最后才可以对污染细胞的相关来源采取比较有效的防治手段进行干涉，减少甚至是控制细胞的污染情况。