抗菌肽抑菌机理及其研究方法

张 宇，姜 宁，张爱忠

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

抗生素产生耐药性的问题日益严重，许多抗生素已经被禁用，抗菌肽作为抗生素的替代品之一，在农业、畜牧业、食品生产和医药卫生等领域被广泛关注。天然的抗菌肽是由生物体内基因编码并通过核糖体合成的小分子肽，具有广谱抗菌性且不易使细菌产生耐药性，其来源十分广泛，可以分为昆虫抗菌肽、植物抗菌肽、哺乳动物抗菌肽、两栖动物抗菌肽、鱼类、软体动物、甲壳类动物抗菌肽、微生物源抗菌肽，其中微生物源抗菌肽容易获得，但是被开发利用的并不多[1]。抗菌肽的结构主要有α-螺旋、β-折叠和环状结构，不同结构的抗菌肽性质特点有所不同[2]。

目前被发现且分离鉴定出结构的抗菌肽已有一千多种，但研究抗菌肽的基本结构只是应用的前提，若要将抗菌肽应用到实际生产，使其真正成为有效的抗生素替代品并充分发挥抑菌效果，发挥应有的作用价值，就必须明确抗菌肽的抑菌机理。同种抗菌肽对于不同的细菌作用部位和机制可能不同，而不同的抗菌肽对于相同细菌的作用也不同。大量的研究表明，抗菌肽的抑菌机制与其来源和结构并没有绝对的关系,但是却有相对的相关性[3]。为此，本文对抗菌肽的抑菌机理及其相应的研究方法进行了综述，以期为抗菌肽的深入研究提供参考。

1 抗菌肽的抑菌机理

1.1抗菌肽作用于细菌细胞壁细胞壁能维持细菌的形状，是保护菌体的最外层屏障，细胞壁一旦被破坏就会引起细菌细胞结构的变化和细胞死亡。抗菌肽作用于细菌时最先接触细胞壁，通过破坏细胞壁的结构发挥抑菌作用[4]。带正电荷的抗菌肽可以与细胞壁中的脂多糖和磷壁酸相结合。Singh等[5]发现，S1系列抗菌肽与脂多糖的结合程度取决于其所带电荷的数量及疏水性的强弱，衍生肽GKY25的两亲性与其同脂多糖和磷壁酸的结合呈显著的线性关系[6]。有研究表明,带正电荷的抗菌肽会取代细胞壁表面带负电的Mg2+和Ca2+并导致细胞壁结构发生改变，抗菌肽能穿过细胞壁作用于细菌细胞膜。很多研究表明，抗菌肽对细菌细胞壁的破坏不仅取决于其所带电荷多少和疏水性强弱，作用于细菌的浓度也会影响抗菌肽对细胞壁的破坏程度。

1.2抗菌肽作用于细菌细胞膜抗菌肽穿过第一道屏障细胞壁后接触到细菌细胞膜，氨基酸残基与磷脂双分子在静电作用下发生结合。抗菌肽通过将疏水端插入细胞膜的输水区域来改变膜的结构或使膜蛋白发生凝聚失去活性，进入磷脂双分子层后亲水端发生结合并形成离子通道，细胞内物质外泄导致菌体的死亡，但只有当膜电势高于110 nv时，离子通道才能开启或关闭[7]。绝大部分抗菌肽的抑菌模式是通过对细胞膜的破坏作用实现的，但抗菌肽与膜的相互作用会受到肽链长度、二级结构、电荷分布情况以及疏水性的影响[8]。抗菌肽对细胞膜的具体作用机制主要有以下四种假说[9-10]。

1.3抗菌肽入胞后的作用机制有些抗菌肽的杀菌方式并不是或不完全是作用于细菌的细胞壁和细胞膜，它们能穿透细胞壁膜进入细胞内，通过阻断细菌核酸（DNA、RNA）的合成、影响蛋白质和细胞壁的形成、抑制胞内酶活性发挥杀菌作用。但有些抗菌肽甚至可以通过抑制细胞呼吸等方式来达到抑菌作用，如某些富含脯氨酸的抗菌肽同细菌的热休克蛋白结合发挥抗菌活性[15]。

1.3.1 抗菌肽对细菌DNA的作用 大量的试验结果表明，某些种类的抗菌肽可抑制核酸物质的合成。来自于两栖动物皮肤的抗菌肽Dermaseptin、来自于牛中性粒细胞的抗菌肽Bac5/Bac7和人汗腺中的抗菌肽Dermcidin均能抑制细菌RNA的合成，而人附睾中的HE2和人嗜中性粒细胞中的HNP-1和HNP-2既能抑制RNA又能抑制DNA合成。苏冠芳等[16]研究发现，buforinⅡ衍生物可以在不破坏菌膜的情况下进入金黄葡萄球菌内与DNA合成基因特异性结合，通过阻止DNA的合成达到抑菌效果。Hao等[17]研究发现buforinⅡ衍生物能插入DNA双螺旋的凹槽内通过干扰碱基对聚集来影响DNA的复制。陈旋等[18]研究发现，抗菌肽P7能嵌入大肠杆菌DNA碱基形成DNA-肽复合物，与rnhA序列发生特异性结合进而影响大肠杆菌的DNA复制和RNA合成。陈飞龙等[19]研究发现，由副干酪乳杆菌FX-6产生的抗菌肽F1以嵌插的方式与金黄色葡萄球菌的DNA结合，影响细胞分裂周期和遗传信息的正常表达。

表1 抗菌肽四种作用机制假说Table 1 Four hypothesis mechanisms of antimicrobial peptides

1.3.2 抗菌肽对细胞壁合成的作用 抗菌肽除在胞外能破坏细胞壁结构，还可以在胞内通过抑制细胞壁的合成和阻止细胞的分裂等方式杀灭细菌。很多种类的抗菌肽都可以通过抑制细胞壁的合成来阻止细胞分裂，如来自于麻蝇的Sarcotoxins、变异链球菌抗菌肽Mutacin1140和放线菌抗菌肽Planosporicin等[16]。细胞壁的主要成分之一是肽聚糖，研究表明放线菌抗菌肽Planosporicin能阻断肽聚糖合成导致细菌细胞壁合成受阻。

1.3.3 抗菌肽对酶的作用 部分抗菌肽可以通过抑制细胞内酶的活性影响菌体代谢。陈飞龙等[19]发现，经抗菌肽F1处理后的金黄色葡萄球菌代谢受到影响，抗菌肽F1降低了细胞内非特异性酯酶及β-半乳糖苷酶的活性。某些种类的两栖动物抗菌肽如aurein 2.2、carein 1.8等，可通过抑制大肠杆菌细胞内ATP生成酶的活性影响其能量代谢，使细菌生长速率下降[20]。刘立伟等[21]发现，抗菌肽能诱发胞内蛋白酶和钙离子外流，刺激细胞色素C释放，通过酶促反应使细胞凋亡。

2 抗菌肽抑菌机制的研究方法

对于抗菌肽不同的抑菌机制可采用不同的研究方法。通常采用电镜技术（透射电镜、扫描电镜）和显微镜技术（原子力显微镜、荧光显微镜和激光共聚焦显微镜等）结合荧光染色技术等来观察抗菌肽对细菌膜的作用；采用SDS电泳、DNA凝胶阻滞、荧光光谱分析、流式细胞技术、蛋白质印记法等方法研究抗菌肽入胞后的作用机制；近年来，通过人工建立生物膜模型和动力学模拟，结合电化学方法、核磁共振技术、荧光淬灭法、圆二色谱法及其他物理学光谱分析法，能更清晰便捷地了解抗菌肽的抗菌机制。

2.1抗菌肽对细菌细胞膜作用机制的研究方法大量的研究表明，细菌外膜是抗菌肽作用的主要部位，通过观察细菌的外部形态以及胞膜结构的完整性可以确定某种抗菌肽的作用靶点是否在细菌的细胞膜上。电镜可以观察到抗菌肽的微观结构变化：细菌壁或膜表面的变化，其中透射电镜可以观察到更加细微的变化，如细菌细胞内外膜发生分离、膜表面出现孔洞、细胞内容物外流等。利用原子力显微镜并借助相关的软件，无需对细菌进行特殊处理即可计算出膜表面产生的孔洞直径大小。电化学扫描隧道显微镜的分辨率较高，可以观察到分子内单个原子的排列情况。这两种显微镜虽然能够观察到极其细微的结构，但在研究中应用较多的是透射电镜和扫描电镜。谢海伟等[22]研究合成的鲎素抗菌肽对大肠杆菌等其他细菌的作用，通过电镜扫描观察发现细菌细胞的微观结构发生较大的变化，细胞表面出现坍塌和破裂。魏晓晓等[23]在扫描电镜下观察到被改造的牛血红蛋白源抗菌肽JH-3可以使金黄色葡萄球菌的发生皱缩、使大肠杆菌的细胞膜表面出现孔洞、使白色念珠菌的表面凹凸不平并出现明显裂痕。刘艳环等[24]通过透射电镜观察发现，抗菌肽MSL可以使金黄葡萄球菌和绿脓杆菌的细胞膜破损甚至导致细胞瓦解，胞内染色质发生聚集现象。李瑞芳等[25]在筛选嗜铬粒蛋白衍生肽时，通过扫描电镜观察CGA-N12可以使热带念珠菌菌体皱缩出现裂缝；通过透射电镜观察，发现其可以使细胞壁与膜之间空隙变窄、颜色变深，细胞器受到破坏。冯兴军等[26]通过透射电镜扫描发现鸭抗菌肽Cath（1-20）和Cath（5-20）能破坏细菌细胞膜，证明鸭抗菌肽的作用靶点就是细胞膜。Krisztina Nagy等[27]通过原子力显微镜观察富含半胱氨酸的抗菌肽NCR247和NCR335均能使大肠杆菌表面粗糙度增加，引起胞膜损伤，进而得出结论：抗菌肽NCR作用于细菌的第一个靶标可能是细菌细胞膜。

通过电镜和原子力显微镜只能观察到未经处理的细菌细胞膜表观形态结构的变化，但是其具体的实质性变化需要通过荧光染色，借助荧光显微镜、激光共聚焦显微镜以及流式细胞仪等技术检测。张倩[28]用PI染色含色氨酸的阳离子抗菌肽，在激光共聚焦显微镜下观察到被荧光标记的抗菌肽出现在细菌细胞质和细胞核。苏冠芳等[16]通过荧光光谱分析发现抗菌肽buforinⅡ衍生物与金黄葡萄球菌的DNA结合方式为嵌入式，通过流式细胞仪探究抗菌肽对细菌细胞周期的影响发现buforinⅡ能特异性地阻滞DNA合成阶段。Bi等[29]用荧光标记的抗菌肽作用于大肠杆菌后在激光共聚焦显微镜下观察到被感染的细菌出现荧光，通过流式细胞仪对不同光信号采集整合并以散点图展示出试验结果。Liu等[30]通过荧光染色和流式细胞技术也发现，在一段时间的作用后DiBAC4染料能进入到90%以上的细菌中。

2.2抗菌肽进入细菌细胞后作用机制的研究方法有些抗菌肽既能作用于细菌细胞膜又能入胞发挥作用，而有些抗菌肽能在不破坏细胞膜的情况下在细胞内找到作用靶点，发挥杀菌作用。SDS电泳、DNA凝胶阻滞、荧光光谱分析、蛋白质印记法等常用来研究抗菌肽入胞之后的作用机制。陈飞龙等[19]通过邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷法、凝胶阻滞电泳、SDS电泳、考马斯亮蓝检测、荧光染色及流式细胞术等方法探究抗菌肽F1对金黄葡萄球菌的抑菌作用发现，抗菌肽F1以嵌插的方式与细菌的DNA结合，进而影响DNA的复制和蛋白质的表达，细胞内的β-半乳糖苷酶和非特异性酯酶的活性降低，细菌生长代谢受阻。陈旋等[18]研究抗菌肽P7对大肠杆菌的非膜作用方式时，通过P7与染色剂结合大肠杆菌DNA的荧光光谱来分析P7与DNA的结合方式；通过流式细胞技术分析抗菌肽与大肠杆菌DNA结合对细胞周期的影响；通过核酸染色及荧光分析探究P7对大肠杆核酸合成的影响。

2.3人工生物膜的建立及动力学模拟抗菌肽与细菌细胞直接接触作用并借助其他试验技术是生物学的验证和研究，而采用人工模拟合成细胞膜及分子动力学模拟等方法，能进一步清晰地阐明抗菌肽与磷脂双分子层的作用方式。

人工建立的生物膜模型有很多，可以采用某一种磷脂或几种磷脂混合构成脂质体，也可采用囊泡模型或者固体支撑膜模型来模拟。一般用磷脂酰胆碱（DMPC）模拟动植物细胞膜；用磷脂酰甘油（DMPG）模拟细菌细胞膜。在建立的模型上通过电化学方法、核磁共振法、圆二色谱法、荧光淬灭法、X-射线结晶学技术、荧光法、拉曼光谱及傅立叶转换红外线（FTIR）等研究方法可以测定出抗菌肽与磷脂双分子的作用方式。在实际的研究中，一般采用上述的某一种方法或几种方法相结合。冉瑜[31]通过电化学的方法将人工脂质体固定修饰到电极形成双层膜，通过电流大小得知膜的完整性，同时采用色氨酸淬灭试验对荧光淬灭，研究脂质体与抗菌肽的作用。圆二色谱法和核磁共振法通常用来检测抗菌肽与细胞膜作用时的二级结构变化。圆二色谱（CD）应用广、简单、快捷，可以测定抗菌肽在不同溶剂中二级结构的变化情况；核磁共振法在进行同位素标记时不破坏样品的结构，样品也不需要结晶处理，更接近于内环境，同时，通过固态和液态核磁共振相结合能进一步清楚了解抗菌肽与细胞膜的作用方式。孙宜君[32]通过圆二色谱研究螺旋藻抗菌肽的抑菌机理时发现，在水中抗菌肽以无规则卷曲形式存在，而在疏水条件下则主要以β-折叠形式存在。叶南慧等[33]利用圆二色谱法和核磁共振法测定不同溶液中沼水蛙抗菌肽的二级结构并研究其抑菌机理，结果表明，沼水蛙抗菌肽的二级结构会因溶剂不同而发生变化。而X-射线结晶学、拉曼光谱及傅立叶转换红外光谱是通过物理学方法，经射线的散射作用获得光谱，进一步分析抗菌肽及生物膜的分子结构变化，目前的应用不及其他方法广泛。Lauren等[34]用和频振动光谱（SFG）研究抗菌肽不同人工模拟的脂质膜作用时发现，大肠杆菌膜脂质提取物模拟的生物膜要优于纯POPG模拟的复合膜。

分子动力学（MD）模拟是多原子系统在外力场的作用下单个原子发生运动，根据运动轨迹和力学统计方法获得体系的力学量和性质。继1977年Karplus等对牛蛋白酶抑制剂进行分子动力学模拟之后，分子动力学方法被广泛应用，随后又被与计算机模拟相结合，使得分子动力学模拟成为生物大分子研究中重要途径之一。利用此模拟方法是从原子水平对抗菌肽与细胞膜作用方式的分析，通过微观角度的观察来验证宏观的试验猜想，进一步明确抗菌肽的作用机理。毛文超[35]利用分子动力学模拟研究抗菌肽LL-37对人工模拟的细菌及哺乳动物红细胞细胞膜的作用，通过不同的力场作用，计算并分析出肽和膜的稳定性及形态结构变化等，得到与实际试验一样的结论。类似的探究和验证抗菌肽作用于细胞膜的试验有很多，虫孔模型和毯式模型都经过此模拟方法得到验证[36]。

研究表明，分子动力学（MD）模拟只能研究抗菌肽作用于细胞膜形成的孔隙情况，而不能研究整个过程的作用情况。所以在MD的基础上衍变出了耗散粒子动力学（DPD）。DPD可以模拟长度为毫米和时间为毫秒的尺度系统，将耗散粒子动力学与静电相互作用相结合，使研究者在较大的时间和尺度上探究抗菌肽在磷脂双分子层上易位的全过程。将静电相互作用结合耗散的粒子动力学模拟探究抗菌肽穿过磷脂双分子层的方式会发现，只有达到肽浓度临界值时抗菌肽才会穿过膜，作用方式为先垂直插入再平行吸附。

3 小结

抗菌肽来源广、种类多，在动植物及微生物体内含量很低，但杀菌作用明显，可通过对细菌细胞壁、细胞膜和胞内物质的作用发挥作用。但由于抗菌肽种类繁多，结构不同，即使是同类抗菌肽对于不同亚群的细菌抑菌机理也有可能不同。近阶段一些研究表明，细菌也会对抗菌肽产生一定程度的耐受性，主要有以下几种途径：通过改变自身细胞膜结构和结合位点影响抗菌肽的结合；通过分泌和释放蛋白降解酶降解抗菌肽；通过改变细胞膜表面的电荷分布，如增加正电荷量减少与抗菌肽的静电吸引作用；通过某种运输机制降低抗菌肽在细胞膜表面的浓度；通过基因突变产生对抗菌肽的耐受性；通过被抗菌肽激活的调节通路和特异性原件抵御抗菌肽。为了避免和解决细菌对抗菌肽的耐药性问题，深入研究不同抗菌肽的抑菌机制是十分重要的，同时这也将成为未来抗菌肽研究领域的一大热点问题。

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