五味子乙素对ICR小鼠的抗焦虑作用及其作用机制

李 贺，李 宁，刘 聪，刘佳乐，王梦阳，庄文越，王春梅，孙靖辉，陈建光

(1.北华大学药学院药理教研室，吉林 吉林 132013； 2.吉林省吉林市中心医院神经内科，吉林 吉林 132001)

焦虑症又称为焦虑性神经症，是最常见的精神障碍之一，其发病率逐年增高[1-4]。研发具有抗焦虑功能的药物及保健食品意义重大。五味子，始载于《神农本草经》，应用历史悠久。本课题组前期研究[5]显示：五味子木脂素具有显著的抗焦虑作用，但其主要活性成分尚不清楚。五味子乙素(schisandrin B，SchB)是五味子木脂素的主要活性成分之一，目前尚无SchB抗焦虑作用的相关报道。本研究通过高架十字迷宫和高架零迷宫观察SchB的抗焦虑作用，并通过检测小鼠外周血和脑组织中γ-氨基丁酸 (GABA)和谷氨酸(Glu)水平以及脑组织中GABAA受体α1亚单位(GABAARα1)及GABAA受体γ2亚单位(GABAARγ2)蛋白的表达水平探讨其相关机制，以期为开发抗焦虑药物及保健食品提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂清洁级ICR雄性小白鼠，体质量(20±2)g，由吉林大学实验动物研究中心提供，动物许可证号：SCXK-(吉)2016-0005。小鼠采取分笼饲养，且维持12 h∶12 h昼夜循环，饲料供给充足，自由饮水。SchB(成都普菲德生物技术有限公司)，生理盐水(黑龙江科伦制药有限公司)，GABA和Glu的ELISA试剂盒(美国分装GBD公司)。

1.2 主要仪器和设备JA精密电子天平和电热恒温水浴锅均购于沈阳市科瑞仪器公司，KQ-50DA超声清洗机购于江苏省昆山市超声仪器公司，TM-Vision小鼠行为学仪器购于成都市泰盟科技公司，FSH-2型高速匀浆机购于江苏省金坛亿通电子有限公司，LD5-10B高速离心机购于北京市离心机厂，生化培养箱(BSP-250)购于上海市博迅公司，全自动酶标仪 购于瑞士TECAN集团公司。

1.3 实验动物分组和给药雄性ICR小鼠，随机分为空白对照组、2.5 mg·kg-1SchB组、5.0 mg·kg-1SchB组和10.0 mg·kg-1SchB组，每组10只。各给药组小鼠灌胃给予相应剂量SchB，空白对照组小鼠给予相同容积蒸馏水，每天1次，容量均为0.1 mL·10 g-1，连续给药7 d，于末次给药后40 min分别进行行为学实验、ELISA实验和Western blotting 法检测。

1.4 小鼠高架十字迷宫实验开始实验时，将实验动物从笼中取出(动物背向实验者)，放置在开臂与闭臂结合的中央区域。实验者迅速安静离开，开启摄像监控器，记录5 min内实验动物进入开臂次数，计算开臂进入次数百分率[开臂进入次数/(开臂+闭臂总次数)]和开臂滞留时间百分率[开臂滞留时间/(开臂+闭臂总时间)]。

1.5 小鼠高架零迷宫实验小鼠高架零迷宫实验原理与高架十字迷宫相同，是由高架十字迷宫发展而来的既传统又新颖的动物行为学系统。高架零迷宫包括一个圆形平台、两个相对开放、两个相对封闭的象限，开放象限和封闭象限区分明显，去除了高架十字迷宫中间的模糊区域，并可以不间断地探测。测量的主要参数有平台边缘探头次数百分率、进入开臂的次数百分率和开臂探头次数百分率等。本研究是通过高架零迷宫实验进一步验证SchB的抗焦虑作用。

1.6 小鼠外周血和脑组织中GABA和Glu水平的检测小鼠于第7天灌胃给药40 min后断头取血，将新鲜血液放至高速离心机中， 4℃、3 000 r·min-1离心10 min，取外周血清；迅速在冰垫上分离出脑组织，用0.9%生理盐水冲去血水，用滤纸吸干多余水分。以组织质量∶生理盐水为1∶9的比例，将其制成浓度为10%的组织上清液。取外周血和脑组织上清液，分别采用ELISA法检测GABA及Glu水平(详见试剂盒说明书)，并计算GABA/Glu的比值。

1.7 Western blotting法检测小鼠脑组织中GABAARα1和GABAARγ2蛋白表达水平小鼠于第7天灌胃给药40 min后，每组取3 只小鼠脑组织，加入裂解液，冰上裂解1 h，入高速离心机离心取上清。采用BCA法测定组织蛋白浓度，以10%SDS-PAGE凝胶电泳分离目标蛋白。2 h电转移至PVDF膜，取出膜在Tris缓冲液(TBST)中漂洗5 min，然后用封闭液 (含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液)封闭1 h。室温孵育后弃去封闭液，分别加入GABAA Rα1和GABAA Rγ2一抗(1∶1 000)，4℃温育过夜后，TBST洗5×5 min。加入二抗(1∶2 000)温育2 h，TBS-T洗5×5 min，最后加入显色液ECL显色。采用凝胶图像处理系统通过灰度值计算其蛋白表达水平。

2 结 果

2.1 各组小鼠高架十字迷宫实验各组小鼠连续灌胃给药7 d，于末次给药后40 min进行高架十字迷宫实验。与空白对照组比较，5.0 和10.0 mg·kg-1SchB组小鼠开臂滞留时间百分率及开臂进入次数百分率均明显升高(P< 0.05或P< 0.01)。见表1。

2.2 各组小鼠高架零迷宫实验各组小鼠连续灌胃给药7 d，于末次给药后40 min进行高架零迷宫实验，应用开臂进入次数百分率及开臂探头次数百分率评价小鼠的焦虑程度。与空白对照组比较，5.0 和10.0 mg·kg-1SchB组小鼠开臂探头次数百分率和开臂进入次数百分率均明显增加(P< 0.01)。见表2。

表1 各组小鼠高架十字迷宫实验中开臂滞留时间百分率(OT%)和开臂进入次数百分率(OE%)

*P<0.05,**P<0.01 compared with blank control group.

表2 各组小鼠高架零迷宫实验中开臂进入次数百分率(OE%)和开臂探头次数百分率(OP%)

*P<0.01 compared with blank control group.

2.3 各组小鼠外周血和脑组织中GABA和Glu水平与空白对照组比较，10.0 mg·kg-1SchB组小鼠外周血和脑组织中GABA水平明显增加(P< 0.01)，Glu水平明显降低(P< 0.01)，GABA/Glu比值明显升高(P< 0.01)。见表3。

2.4 各组小鼠脑组织中GABAARα1和GABAARγ2蛋白表达水平与空白对照组比较，10.0 mg·kg-1SchB组小鼠脑组织中GABAARα1和GABAARγ2蛋白表达水平均明显升高(P<0.01)。见图1。

3 讨 论

SchB为五味子中含量最高的联苯环辛烯类木脂素。大量研究[6-8]表明：SchB 具有抗氧化、抗肿瘤和抗炎等多种药理作用，但目前尚未见其抗焦虑作用的相关报道。本研究通过高架十字迷宫实验和零迷宫实验，采用开臂探头次数百分率、开臂进入次数百分率和开臂探头次数百分率等指标来观察SchB的抗焦虑作用。开臂探头次数百分率、开臂进入次数百分率及开臂探头次数百分率越高，表明受试小鼠焦虑程度越低[1-3,9]。本研究结果显示：在高架十字迷宫实验中，中和高剂量SchB组小鼠开臂滞留时间百分率及开臂进入次数百分率较空白对照组均明显增高；在零迷宫实验中，中和高剂量SchB组小鼠开臂探头次数百分率及开臂进入次数百分率较空白对照组均明显增加。提示SchB对受试小鼠具有抗焦虑作用。在上述2个行为学实验中，与空白对照组比较，低剂量SchB组小鼠各指标均未见明显变化，中和高剂量SchB组之间比较也无明显变化，提示SchB的抗焦虑作用的剂量效应关系尚需进一步深入研究。

表3 各组小鼠外周血和脑组织中GABA和Glu水平及GABA/Glu比值

Tab.3 Levels of GABA and Glu in peripheral blood and brain tissue and radios of GABA/Glu of mice in various groups

表3 各组小鼠外周血和脑组织中GABA和Glu水平及GABA/Glu比值

GroupGABA[wB/(ng·mg-1)]BloodBrainGlu[wB/(ng·mg-1)]BloodBrainGABA/GluBloodBrainBlankcontrol59．83±5．3345．87±5．9564．87±7．7255．87±5．950．93±0．110．81±0．0210．0mg·kg-1SchB74．14±9．14∗56．00±1．87∗51．14±3．97∗47．67±1．47∗1．46±0．27∗1．17±0．01∗

*P<0.01 compared with blank control group.

Lane 1:Blank control group; Lane 2:10.0 mg·kg-1 SchB group. n=3;*P<0.01 compared with blank control group.

Glu是哺乳动物体内最重要的具有兴奋作用的神经递质， GABA是哺乳动物体内重要的具有抑制作用的神经递质。研究[10-12]显示：当焦虑发生时，动物体内Glu水平升高，GABA 及GABA/Glu比值降低。GABA与Glu比例的平衡与焦虑症的发生密切相关。本研究选取高剂量SchB组小鼠观察SchB对GABA和Glu水平的影响，结果显示：与空白对照组比较，SchB给药组小鼠外周血及脑组织中Glu水平降低， GABA 水平升高，GABA/Glu比值升高，提示SchB对小鼠的抗焦虑作用与其调节小鼠体内Glu、GABA 水平及GABA/Glu比值有关。

GABA的生理功能主要通过其与GABA受体特异性结合而产生。GABAA受体(GABAAR)是介导抗焦虑效应的主要功能受体。GABA 作用于GABAAR上，使神经细胞膜的Cl-离子通透性增加，细胞内离子浓度低于细胞外，使Cl-离子顺浓度差进入细胞内，细胞膜内的负电位进一步增加，细胞由极化变为超极化，进而发生抑制效应，从而表现为抗焦虑作用。在成熟脑中，GABAARα1与GABAARγ2亚单位的组合在脑内广泛表达，是GABAAR的重要功能基团，GABAARα1和GABAARγ2 表达下调，与焦虑的发生有密切关联[13-17]。本研究结果显示：SchB能够明显增加小鼠脑组织中GABAARα1和GABAARγ2蛋白的表达水平，提示SchB对小鼠的抗焦虑作用与其上调GABAARα1与GABAARγ2蛋白的表达水平有关。

综上所述，SchB 对小鼠具有抗焦虑作用，该作用可能与调节小鼠外周血和脑组织中的GABA、Glu水平和GABA/Glu比值及脑组织中的GABAARα1和GABAARγ2蛋白表达水平有关。本研究为开发抗焦虑药物及保健食品提供了理论依据。

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