猪繁殖与呼吸综合征病毒的控制策略研究进展

邹伟斌, 林梓栋, 齐冬梅

(广东永顺生物制药股份有限公司, 广东 广州511356)

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种具有高度传染性的猪病毒性疾病,其主要临床症状表现为母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难与高死亡率,对世界猪养殖业造成了严重的经济损失。 免疫PRRS 灭活疫苗或减毒活疫苗是目前防控猪繁殖与呼吸综合征的主要手段,但由于PRRSV 具有抗原变异快、持续性感染和免疫抑制等特点,临床上常常会出现免疫失败或疫情加重的情况。 目前我们对PRRSV 的病毒学、起源和进化的了解以及宿主对PRRSV 免疫应答的认知还十分不足,这极大地阻碍了对根除PRRSV 有效方法的开发。 本文主要通过对PRRSV 控制策略和技术研究的最新进展进行综述,为未来PRRSV 的控制和预防以及PRRS 新型疫苗的研发提供参考。

1 PRRSV 的简介

1987 年,美国北卡罗来纳州的农场暴发了一种神秘猪病,主要表现为母猪繁殖障碍、断奶猪肺炎和生长发育猪的死亡率增加[1]。 1991 年,该神秘猪病的病原在欧洲被分离发现,是一种以前未被鉴定的RNA 病毒,并被命名为莱利斯塔德病毒(Lelystad virus)[2]。 随后北美地区也很快分离到了病原,并最初称之为猪不育和呼吸综合征病毒(Swine infertility and respiratory syndrome virus,SIRSV)。 1992 年,这种病原被引进了新的命名“猪繁殖与呼吸综合征病毒”[1],后来被广泛接受并被沿用至今。 从两个不同大陆分离的PRRSV 被分为两个基因型：1 型(或称为欧洲型,代表株为Lelystad 株)和2 型(或称为北美型,代表株为VR -2332 株)[3],两个基因型之间的基因相似率约为60%。 PRRSV 具有高度限制的细胞嗜性,只感染单核-巨噬细胞,如猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM),PAM 是PRRSV 在体内的主要靶细胞[4]。

PRRSV 属于动脉炎病毒科(Arterividae)、动脉炎病毒属(Arterivirus),其基因组为大小约15 kb 的单股正链RNA,其5′端是复制酶基因,3′端的是编码结构蛋白的基因[5]。 目前已知至少包含10 个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),其中ORF1a和ORF1b 的占全基因组的长度超过三分之二,编码两个大的多聚蛋白,最后切割成14 个非结构蛋白。而目前已知的8 个结构蛋白分别由ORF2a,ORF2b,ORF3-7 和ORF5a 编码[1]。

自从PRRSV 被鉴定以来,新的PRRSV 毒株不断进化并在全世界引起新的疫情暴发,使得PRRSV控制的难题一直以来有些令人吃惊。 除了高死亡率和发病率外,PRRSV 感染还能造成宿主易继发感染其他病毒和细菌。 目前除了疫苗外,对于感染动物尚且没有PRRSV 特异性的治疗和预防方法。然而,许多控制PRRSV 的新策略正在被研究与开发。

2 针对PRRSV 的抗病毒策略

2.1 一些miRNA 能够抑制PRRSV 的复制 MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于动物和植物中的内源性非编码的长度约为20 ～25 nt 的单链小分子RNA[6]。 研究证明,miRNA 在病毒复制过程中发挥着作为关键调节因子的重要作用[7]。 miRNA 可以通过靶向PRRSV 基因组或宿主与PRRSV 复制有关的因子以及PRRSV 复制有关的信号通路来调控病毒的复制。 miRNA -181 与ORF4 下游的保守区域结合而抑制PRRSV 的复制[8]。 miRNA let-7f-5p通过作用 PRRSV 的受体非肌球蛋白重链9(MYH9)来抑制PRRSV 的复制[9],miRNA - 506通过靶向细胞分化抗原151(Cluster of differentiation 151,CD151)来阻碍PRRSV 的复制[10]。 miR -125b则通过上调NF-κB 信号通路降低PRRSV 的复制[11]。 这些能够抑制PRRSV 病毒复制的miRNA将可能成为未来防控PRRS 的工具。

2.2 RNA 干扰技术 RNA 干扰(RNA interference,RNAi)能够诱导特异性的基因沉默,在动物传染病的防治上应用已较为广泛。 RNAi 相关的分子包括小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)和吗啉低聚物(PMO)等,研究报道针对PRRSV 基因的特异性RNAi 分子能够有效抑制PRRSV 的感染。 研究发现,靶向NSP1α 的siRNA 能够显著抑制PRRSV 在MARC-145 细胞上的复制[12]。 Xie 等[13]设计的特异性靶向Nsp9 基因的siRNA 能够有效抑制PRRSV 的复制。 特异性靶向Nsp11 的siRNA 也能够降低PRRSV 在MARC-145 细胞上的病毒滴度[14]。Li 等[15]研究发现,靶向PRRSV ORF1 的shRNA 能够显著抑制PRRSV 的复制。 鼻内接种抗核酸酶寡核苷酸类似物pmo-5up2 能够显著降低PRRSV 病毒血症和病毒引起的间质性肺炎,表明pmo-5up2 有望成为一种新型的PRRS 控制候选产品[16]。 总之,基于这些小分子的RNAi 技术可能是未来控制PRRSV的有效抗病毒策略。

2.3 基因编辑技术用于控制PRRSV PRRSV 具有高度限制的细胞嗜性,研究表明,PRRSV 感染依赖各种细胞受体或因子,如硫酸肝素(Heparin sulfate,HS)、波形蛋白(Vimentin)、CD151、CD163、唾液酸粘附素CD169、CD209 和MYH9 等[5]。 但最近的研究表明,只有CD163 是PRRSV 在体内和体外感染不可或缺的[17]。 Whitworth 等[18]研究表明,CD163基因敲除猪能够抵抗PRRSV 的感染。 CD163 的结构域SRCR5 是PRRSV 感染所必需的,CD163 的SRCR5 缺失猪能够完全阻止PRRSV 的复制[17]。Whitworth 等[19]通过基因编辑技术对CD163 的SRCR5 进行修饰得到的转基因猪能够有效预防PRRSV 的感染。 因此,对CD163 的基因编辑有望成为防治PRRSV 感染的新方法。

2.4 中草药提取物和天然化合物能够抑制PRRSV的复制 中草药提取物被证明能够抑制PRRSV 的复制。 Sun 等[20]通过研究发现,丹参酮IIA 能够通过抑制N 基因的表达和阻断病毒诱导的细胞凋亡来抑制PRRSV 的复制。 茶叶中含量最丰富的表没食子儿茶素没食子酸酯也能抑制PRRSV 感染MARC-145 细胞[21]。 茶叶天然提取物中的茶籽皂甙也能抑制PRRSV 的复制,且其抗病毒机制与丹参酮IIA 相同[22]。 一些化合物能够抑制PRRSV的感染,如绵马鳞毛蕨中的化合物黄绵马酸AB 能够抑制PRRSV 在细胞与细胞之间的传播,而且能够显著诱导PAM 中抗病毒细胞因子IFN-α、IFN-β和IL1-β 的表达[23]。 Zhang 等[24]研究表明,来自海洋真菌的蒽醌类衍生化合物TD-C 对PRRSV 的内化和复制过程具有抑制作用。 然而,所有这些相关研究缺乏体内的抗PRRSV 效果评价试验。另外,这些化合物的抗PRRSV 活性是非特异性的,且其抗病毒活性的具体机制也尚不清楚。 因此,这些化合物制剂在PRRS 的防控方面还未得到实际应用。

2.5 纳米抗体 纳米抗体(Nanobody,Nb)是指来源于骆驼血液中的只由一个重链可变区组成的单链抗体片段,也称为仅含重链可变区的骆驼重链抗体(Variable domains of Camellidae heavy chain-only antibodies,VHH)或骆驼单域抗体(Camel single-domain antibodies)。 纳米抗体分子量小(仅有15 kDa),易于进行遗传操作,特异性强,可溶性极高且十分稳定,现已广泛用于治疗性生物制品和临床诊断工具的开发。

Liu 等[25]首次研发了抗PRRSV 的纳米抗体,从VHH 的噬菌体展示库中分离筛选得到PRRSV Nsp9蛋白的特异性纳米抗体Nb6,再利用慢病毒载体系统建立稳定表达Nb6 的MARC -145 细胞系,试验结果表明,胞内表达的纳米抗体Nb6 能够通过抑制病毒基因组的复制和转录有效地抑制PRRSV 的复制。 此后,Liu 等[26]又利用相同的研究方法开发的基于PRRSV Nsp4 蛋白的纳米抗体也能够有效抑制PRRSV 在MARC-145 细胞中的复制。 因此,纳米抗体在开发PRRSV 控制新策略的研究方面表现出良好的发展潜力。

2.6 新型PRRSV 疫苗的研发 PRRSV 毒株的基因和抗原的不断快速变异使得现有疫苗对PRRS很难起到有效的防控作用。 此外,近年来PRRS 活疫苗的广泛使用也在一定程度上加速了PRRSV毒株的遗传变异和免疫逃避能力的进化。 许多诸如此类的难题给目前PRRS 的防控带来了严峻挑战。 因此,利用不断发展的分子生物学技术开发新型的广谱PRRSV 疫苗将是未来PRRS 防控的重要方向之一。

目前,新型PRRSV 疫苗的研究重点方向是交换来自不同PRRSV 毒株的结构蛋白基因片段以求得到交叉保护效果优良、具有广谱免疫反应且安全性高的疫苗毒株。 Zhou 等[27]通过改组不同PRRSV 毒株间的GP4 和M 得到的新型嵌合病毒可以增强异源性交叉中和抗体的诱导能力,从而能够对多种异源性PRRSV 毒株产生免疫保护。 最近的一项研究报道,通过改组来自6 个异源毒株的结构蛋白基因(ORF3 -6),然后插入到作为骨架的PRRSV VR-2385 株中拯救得到的嵌合病毒表现出优良的能够抵抗多种异源毒株的交叉保护效力[28]。此外,Vu 等[29]通过对59 种PRRSV 毒株的全基因组进行比对,然后采用计算的策略合成了1 株基因组为人工免疫原性序列的PRRSV 疫苗毒株PRRSVCON,动物实验结果表明,该合成毒株具备了前所未有的异源性交叉免疫保护水平。 这些研究将为具有广谱免疫保护性PRRSV 疫苗的开发奠定重要基础。

3 结语及展望

自1987 年PRRS 首次暴发以来,人们致力于PRRSV 致病机制和改进疫苗的研究,虽然付出的努力颇多,然而在PRRS 的防控方面取得的成功却是比较有限。 免疫接种仍然是目前防控PRRSV的最常用方法,但使用现有疫苗的免疫接种却收效甚微,这与PRRSV 的病原变异快和复制的免疫机制密切相关。 为了更好地控制PRRSV,研究者们正致力于开发新的防控策略。 抑制PRRSV 复制miRNA 的发现、RNAi 技术和基因编辑技术虽然为PRRSV 的控制提供了很好的思路,但在实际应用中需考虑转基因食物的安全问题。 纳米抗体用于PRRSV 的防控研究还较少,开发双特异性甚至多特异性的抗PRRSV 的纳米抗体或将会有更好的应用前景。 通过人工交换或改组遗传元素构建交叉保护好的PRRSV 嵌合病毒用于新型的研发可以有效地解决现有疫苗异源性保护差的问题。随着分子生物学发展的日新月异以及各种先进基因工程技术的开发和广泛应用,期望在不久的将来开发出基于上述技术的新型PRRSV 疫苗,并使之成为防控PRRSV 的有效工具且广泛应用于临床。