水貂阿留申病诊断技术的进展

李 俚, 胡 哲, 孙金辉, 关东嵩, 方孟颀, 王晓钧, 路义鑫

(1.东北农业大学动物医学学院, 黑龙江 哈尔滨150030 ;2.哈尔滨海关, 黑龙江 哈尔滨150028 ;3.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江 哈尔滨150069 ;4.大庆海关, 黑龙江 大庆163311)

水貂阿留申病(AMD)是由水貂阿留申病毒(AMDV)引起的一种能够引起自身免疫紊乱的慢性进行性传染病。 引起该病的病毒可感染各个年龄段的水貂,依据感染毒株类型的不同,病症呈多样性。 对新生仔貂而言,AMDV 引起的死亡率几乎可达到100%;而对于成年水貂,该病通常引起水貂的持续感染,并表现为终生病毒血症、高蛋白血症、动脉血管炎和由病毒-抗体复合体诱导的肾小球肾炎及肝炎等。

临床上还没有能够防治AMD 的有效疫苗和药物,因此目前防控该病的手段主要为水貂新引入前的检疫、场址的彻底消毒,以及感染貂群中病畜的扑杀。 大多数情况下,水貂感染AMD 后没有典型的临床症状,确诊主要依赖于实验室的检测。 本文对近年来国内外AMD 的主要诊断方法及特点进行综述,以期为新水貂引入前的检疫、环境消毒效果的评价及感染貂场AMD 的防控提供方法依据。

1 AMDV 的血清学检测方法

1.1 碘凝集试验(IAT) IAT 是1962 年由Henson等[1]最先用于鉴别AMD 的血清学方法。 因该方法成本低廉、操作简单,所以很容易被推广。 但水貂感染AMDV 后产生的丙种球蛋白水平通常需要1个月的时间才能被检测到,因此IAT 不适用于AMD初期感染的检测。 另外,IAT 为非特异性试验,对能够产生高丙种球蛋白血症的其他慢性疾病,如结核病和肾病等同样可以发生反应,所以单纯使用该法无法达到根除AMD 的目的,目前IAT 已很少被规模化的水貂养殖场采用。

1.2 对流免疫电泳(CIEP) CIEP 作为特异性检测抗AMDV 抗体的血清学方法,最早的使用是在20世纪70 年代,而后成为了AMD 防控的重要诊断技术并在世界范围内广泛应用。 Farid 等[2]于1998 -2005 年对加拿大新斯科舍省AMD 的流行情况进行了调查,对比了用CIEP 方法对AMD 进行持续监测(发现阳性动物并剔除)、间断监测,以及从不检测的农场的血清学检测结果。 结果显示,持续监测的23 个农场的CIEP 平均阳性率为2.2%,且其中的2个农场在后4 年始终保持为全群CIEP 结果阴性;间断监测的33 个农场的平均阳性率为8.55%;而2个从不检测农场的阳性率分别为75.8%和84.6%。这表明使用CIEP 对阳性个体及时淘汰的策略对降低感染水貂数量有明显效果,但不能做到绝对的根除。 戚永娜等[3]在2014 -2015 年通过IAT 和CIEP两种试验方法对山东红岛地区的30 只45 日龄水貂进行了AMD 感染情况调查,结果发现CIEP 法的阳性检出率为63.33%,而IAT 法的检出率为0,进一步证实了CIEP 在特异性和敏感性方面要远远高于IAT。

1.3 ELISA 方法 在欧洲,AMDV 的抗体检测已被列入一些水貂养殖国家的国家性根除计划。 仅就丹麦而言,每年都有约400 万计的水貂样品需要进行血清学检测。 为了能够降低人力成本,使AMD的检测更适于自动化操作,ELISA 方法逐渐建立起来。 目前在北欧国家普遍使用的ELISA 主要有两种,一种是基于AMDV-G 抗原的;另一种是基于重组AMDV-VP2 抗原的。 Dam-Tuxen 等通过对2 436份水貂样品检测,将AMDV-GELISA 同CIEP 的检测性能进行比较,证明了AMDV-G ELISA 比CIEP 的敏感性高,但特异性低。 Andersson 等[5]以CIEP 为“金标准”比较了两种ELISA 方法的检测性能。 结果显示,AMDV-G ELISA 的敏感性为54.3%,特异性为93.2%;而AMDV-VP2 ELISA 的敏感性和特异性分别是99.7%和98.3%,在检测性能方面可完全取代CIEP。 与之相比,中国学者Chen 等用重组的VP2 核心抗原片段VP2332-452蛋白为抗原建立了ELISA;Ma 等[7]用表位预测方法选择并合成了氨基酸序列为aa415 ～aa433 的短肽建立了ELISA。 这两种基于抗原表位理论建立的ELISA 方法在临床样品的应用中被证实,在敏感性和特异性方面均比CIEP 优越。 李晶等[8]用重组AMDV-VP2 作为抗原建立了Dot-ELISA 方法,在78 份临床样品的检测中,Dot-ELISA 的检出率为84.6%,CIEP 的检出率为80.8%,证明了建立的Dot-ELISA 要比CIEP 更敏感。 王元智等[9]用重组AMDV-VP2 为抗原制备了鼠源的单克隆抗体,并建立了双抗夹心ELISA 检测方法。 此外,在国内的早期报道中,吴威等[10]曾用AMDV-G 感染CRFK 细胞,建立了PPA-ELISA 检测方法,经证明其敏感性要比CIEP 高16 倍以上,但由于该实验所需实验室条件要求高,操作复杂,所以没有应用到实际检测中。

1.4 免疫胶体金 为了便于农户自行检测水貂的患病情况,徐磊[11]以原核表达的AMDV-VP2 的主要抗原区作为检测抗原,研制出了AMDV 胶体金快速诊断试纸,其敏感性是CIEP 的2 倍以上。 这种方法的优势是不需要仪器设备,易学易懂,易于在基层推广。 但该方法中的胶体金颗粒易与带有正电荷蛋白发生非特异性的结合引起假阳性,从而使结果不准确。

2 AMDV 的病原学检测方法

2.1 普通PCR 方法 普通PCR 是目前为止在AMDV 检测方面应用最广泛的病原学检测方法。 该方法通常是在AMDV 的NS1 基因或VP2 基因的保守区设计一对引物,通过对样品中可能存在的目的基因片段进行扩增,以达到检测AMDV 的目的。 1996年,Oie 等在对AMD 通过浣熊进行传播的研究中,根据VP2 基因设计了一对引物。 自此以后,国内外很多有关AMDV 检测的文献中均提到了这对引物。Jensen 等根据AMDV 的NS1 基因建立了PCR 方法,并在2008 -2010 年,通过对水貂组织样品同时进行PCR 与CIEP 方法的检测,证实了CIEP 方法存在“假阴性”的可能。 Farid 等[14]在对加拿大新斯科舍省的12 种皮毛动物感染AMDV 的患病率开展调查时,发现有6 种动物存在PCR 或CIEP 阳性结果,该结果表明AMDV 可在毛皮动物间引起流行,对养殖水貂及易感野生动物存在威胁。 国内,许秋等[15]基于NS1 基因建立的PCR 方法能够检测到病毒的最低限量为2.53 ng/μL,在对30 份水貂样品检测时发现PCR 检出率为90%,而用CIEP 方法,检出率为83%。 邵西群等[16]利用CIEP 和PCR 方法对自然感染2 年的貂场进行AMD 的检测结果对比,发现在早期感染的水貂及不产生抗体的AMDV 携带者中,CIEP 结果存在“假阴性”,进而解释了利用CIEP 方法根除AMDV 计划失败的原因。 此外,杨瑞梅等[17]将胶体金颗粒加入PCR 体系中建立了AMDV的纳米PCR 检测方法,该方法可对含有低毒量的粪尿样品进行检测,且敏感性是普通PCR 的10 倍。马芹等[18]使用DNA/RNA 提取试剂盒和一步法扩增试剂盒建立了多重PCR,该方法可对AMDV、水貂病毒性肠炎病毒和犬瘟热病毒的单一或混合感染的样品进行同时检测,这在实际水貂疫病防控过程中大大降低了工作量,节约了检测成本。

2.2 荧光定量PCR(qPCR) qPCR 是在普通PCR基础上加入了能够与DNA 双链特异性结合的荧光标记探针或荧光染料,利用累积的荧光信号量达到定量的目的。 具有敏感性高、特异性强的特点。 国外对qPCR 的报道较少。 2014 年Bowman 等[19]在对安大略地区水獭感染AMDV 的情况进行调查时,使用了基于SYBRGreen 染料的qPCR,但该qPCR 的引物是由Oie 在1996 年设计的。 Prieto 等在调查AMDV 在环境中的分布时,使用了基于NS 基因的Taq Man 定量PCR 试剂盒,然而有关该qPCR 的引物和探针序列的信息并没有提到。 我国学者张秀丽等[22]用SYBRGreenI 染料建立了染料法的qPCR,该方法的敏感性为10 拷贝/μL。 随后,贾赟等[23]根据AMD-VP2 基因,用MGB 探针建立了Taq Man 荧光定量PCR,临床检测40 份样品,阳性率为52.5%,比普通PCR 的检出率高出了7.5%。 qPCR 方法因具有极高的灵敏性,所以在实际应用中更适用于水貂养殖场区消毒后的效果评价和在无AMD 疫病水貂引入前对养殖环境中可能含有AMDV 的检测。

2.3 环介导等温扩增(LAMP)检测方法 LAMP检测方法是一种恒温核酸扩增方法,是利用链置换DNA 聚合酶,在恒温条件下,通过多条靶基因的特异性引物进行核酸扩增反应的。 田国宁等[24]基于AMDV-VP2 基因建立了LAMP 检测方法。 采用该方法的显色法检测时,当样品DNA 含量为10 拷贝/μL 仍可通过肉眼观察到检测结果。 张卓[25]通过在反应体系中添加荧光指示剂建立了可视化LAMP。通过与普通PCR 比较,敏感性高达100 倍。 该方法用时少,检测成本低,并且不需要昂贵的设备,在AMDV 检测的基层推广中有着良好的前景。

2.4 基因检测芯片技术 朱善元等[26]根据探针反相杂交技术,利用基因芯片、核酸分子碱基互补配对及酶联显色技术的原理制成了能够检测AMDV 的基因检测芯片。 应用该方法对160 份临床样品进行检测,阳性检出率为51.25%,比平行检测的Dot-ELISA试剂盒的检出率高17%。 该方法适合对患病早期、抗体水平产生不高的AMD 感染动物的确诊。

3 展望

综上所述,ELISA 具有敏感性高且可实现高通量检测的特点,在丹麦、芬兰等国家该方法目前已取代CIEP 作为官方指定AMD 检测方法。 但就诊断的准确性来讲,病原学检测方法可直接检测到样品中存在的病原体,不受AMDV 早期感染和潜伏感染的影响。 如不考虑该方法经济和时间成本因素,用血清学方法结合PCR 方法有可能实现一个养殖场AMDV 的根除。 尽管qPCR 同其他检测方法相比成本相对较高,但因其具有极高的灵敏性所以更适用于对AMD 传播途径的研究和对水貂养殖环境的评价。

目前,AMDV 的感染在我国水貂养殖场中已呈普遍存在趋势。 尽管成年貂患病后很少死亡,但AMD 能增加母貂的空怀率,使仔貂死亡率增高,降低毛皮品质,从而给水貂产业带来严重经济损失并危害着水貂业的健康发展。 因此,根据不同规模水貂场的养殖条件及防疫需求合理选择一种或综合选择几种可靠的诊断方法对该病的防控具有重要的意义。