二化螟生理生化与分子生物学研究进展

徐刚，叶恭银

(1.浙江大学昆虫科学研究所水稻生物学国家重点实验室 农业农村部作物病虫分子生物学重点实验室，浙江 杭州 310058;2.扬州大学 园艺与植物保护学院，江苏 扬州 225009)

二化螟(Chilosuppressalis)在亚洲、北非和南欧是最重要的水稻害虫之一。二化螟幼虫在水稻叶鞘和茎秆内钻蛀为害，形成枯心、白穗及虫伤株等[1]。在中国，二化螟每年都能造成严重的生产损失，化学防治目前依然是主要的防治手段，但是二化螟已对多种农药产生抗性[2]。二化螟基因组测序、转录组测序和小RNA测序的不断完成，为研究二化螟生理生化特性和基因功能提供了坚实的基础。CRISPR/Cas9技术在二化螟中已得到成功应用[3]，将为今后二化螟基因功能的解析、开辟二化螟新型防控技术提供坚实的技术支撑。为此，本文就近年来有关二化螟基因组及功能基因、抗药性、对Bt抗性的分子机制、神经受体、嗅觉相关基因、热休克蛋白，以及被寄生蜂调控等相关研究的最新进展进行概述。

1 二化螟基因组及功能基因

随着组学及相关技术的迅速发展，二化螟基因组及功能基因组研究也得以发展。在完成二化螟基因组测序的基础上，二化螟基因组数据库ChiloDB已构建。该数据库收录了二化螟的基因组、转录组和小RNA数据，为二化螟研究提供了开放的数据平台[4-5]。另外，二化螟的中肠、脂肪体、血细胞、触角、信息素分泌腺和神经系统等不同组织的转录组测序[6-11]也为二化螟功能基因研究提供了基础。基于基因组和转录组数据，二化螟的类胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶[12]、类丝氨酸蛋白抑制剂[13]、类半胱氨酸蛋白酶[14]、P450[15]和几丁质酶[16-17]等基因家族被鉴定分析，这些研究为深入解析各家族基因的功能奠定了很好的大数据基础。

2 二化螟抗药性机理

使用杀虫剂仍是防治二化螟最重要的手段，持续使用单一杀虫剂会导致二化螟抗性的快速发展，因此监测杀虫剂抗性将为二化螟的综合防治提供必要的信息。2010—2012年，研究人员调查了我国7省55个二化螟田间种群对双酰胺类杀虫剂的敏感性，发现大多数种群对氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺仍处于敏感水平阶段，只有少数种群对这2种双酰胺类杀虫剂表现出低到中等水平的抗性，如浙江象山和浙江苍南二化螟田间种群对氯虫苯甲酰胺表现出低水平抗性，湖北武穴种群对氯虫苯甲酰胺表现出中等水平抗性[18-19]。另有研究发现，江苏仪征、湖南东安、浙江象山及江西上高等田间种群对氟苯虫酰胺表现出低水平抗性(5.1～9.3倍)，浙江金华种群对氟苯虫酰胺产生了11.8倍的中等水平抗性[20]。2015年，在我国7省开展的19个二化螟田间种群对氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺的抗药性检测发现，浙江象山种群对氯虫苯甲酰胺表现87.9倍的中等水平抗性，浙江苍南和余姚种群分别表现135倍和141.1倍的高水平抗性，这3个地区的种群对氟苯虫酰胺都表现为中等抗性(15～58.7倍)[21]，说明上述地区的二化螟可能已经对双酰胺类杀虫剂产生了较高水平的抗性。可见加强抗药性监测及有关机理研究很有必要。

关于二化螟对新型药剂抗性的机理研究也取得了一定进展。鱼尼丁受体(RyR)被认为是二酰胺类杀虫剂的作用靶标，二化螟的RyR已成功地被克隆分析[22-23]。在对氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺的抗性分别达到77.6倍和42.6倍的二化螟种群中，Yao等[2]检测到RyR第4 946位的甘氨酸(G)突变为谷氨酸(E)(G4946E)。先前在小菜蛾上的研究表明，RyR的G4946E突变会导致药剂与受体的结合能力下降，这是其对双酰胺类杀虫剂产生抗性的重要机制[24]。增效试验发现，二化螟对双酰胺类杀虫剂的抗性与3种解毒酶[P450、谷胱甘肽S-转移酶(GST)和酯酶(EST)]没有明显的相关性。然而，Lu等[25]发现，G4946E突变与二化螟对氯虫苯甲酰胺的抗性没有显著的相关性，认为可能是EST在二化螟对氯虫苯甲酰胺产生抗性的过程中发挥作用。Sun等[26]在氯虫苯甲酰胺二化螟抗性种群中发现了RyR一个新的突变Y4667D，而另一个保守的突变I4758M发生的频率达到94.4%。与敏感种群相比，氯虫苯甲酰胺抗性种群中RyR的mRNA表达水平显著下降。使用氯虫苯甲酰胺处理之后，所有种群的RyR表达水平均会下降到50%左右。增效评估和酶活试验显示，EST和P450可能参与了二化螟对氯虫苯甲酰胺的抗性。同时，Xu等[27]发现，P450基因CYP6CV5、CYP9A68、CYP321F3和CYP324A12在二化螟对氯虫苯甲酰胺抗性种群中显著高表达，RNAi试验也证实这些P450基因参与了二化螟对氯虫苯甲酰胺的抗性。亚致死浓度的氯虫苯甲酰胺可以延缓二化螟的发育、降低其繁殖力，卵黄蛋白(Vg)的表达水平也随之下降[28]。同时，亚致死浓度的氯虫苯甲酰胺也可以诱导二化螟保幼激素(JH)合成基因(JHAMT、FPPS1和FPPS2)表达水平上升，进而提高JH浓度[29]。

3 二化螟Bt相关受体蛋白

二化螟是转Bt基因水稻的一个重要靶标害虫，其中，苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis(Bt)的杀虫晶体蛋白Cry通过结合靶标昆虫中肠刷状缘膜囊泡(BBMV)上的特异受体发挥其杀虫活性。通过配体印迹和质谱方法，在二化螟中肠中鉴定到了可能的Cry1Ab毒素受体蛋白氨肽酶(APN)，从二化螟中肠克隆得到APN不同基因型的全长，通过RNAi干扰掉APN1、APN3a和APN5，降低了二化螟幼虫取食转Cry1Ab水稻的死亡率[30]。同时，另一篇研究显示，干扰掉APN1和APN2，取食转Cry1Ab和Cry1Ac融合基因的水稻TT51和转Cry1Ca基因的水稻T1C-19，二化螟幼虫的死亡率显著降低[31]。钙黏蛋白(CAD)是一类钙离子依赖的细胞黏附蛋白，被认为是Cry蛋白的受体之一[32]。通过喂食siRNA降低二化螟CAD1和CAD2的表达，再取食转Cry2A和Cry1C的水稻，幼虫的死亡率下降[33]。碱性磷酸酶(ALPs)在鳞翅目中被认为与Cry蛋白的毒性有关[34]。在二化螟中有6个ALP(ALP1～6)，通过喂食双链RNA的方法干扰掉不同的ALP，结果显示，干扰掉ALP1、ALP2和ALP4能显著降低二化螟幼虫对转Cry1Ab/Cry1Ac水稻的敏感性，干扰掉ALP1、ALP2、ALP3、ALP4和ALP6能降低二化螟对转Cry2Aa水稻的敏感性，干扰掉ALP1、ALP2、ALP3、ALP4和ALP5显著增强二化螟对转Cry1Ca水稻的抗性[35]。研究表明，活化蛋白激酶(MAPK)p38的磷酸化能提高二化螟对Cry毒素的抗性[36]，在二化螟中干扰掉p38，取食转Cry1Ca的水稻或掺入Cry1Ca蛋白的人工饲料，幼虫的死亡率显著上升[37]，由此可见，MAPK p38能增强二化螟对Cry1Ca的抗性。

4 二化螟神经受体

神经递质是化学突触传递中的信使，在突触前末梢通过不同的合成酶作用产生，通过胞吐作用释放到突触间隙，随后与位于突触后膜上的神经受体互作，调控不同的生理与行为过程。通过对二化螟中枢神经系统进行转录组测序，解析了二化螟的神经递质信号系统，包括章鱼胺(OA)、酪胺(TA)、多巴胺(DA)、5-羟色胺、组胺、谷氨酸、乙酰胆碱和γ-氨基丁酸(GABA)[9]。通过构建神经受体的真核表达载体，将其在哺乳动物细胞系(HEK-293)中稳定表达，解析了二化螟生物胺受体的药理学特性，包括章鱼胺受体OA1[38]、OA2B2[39]和OA3[40]，酪胺受体TA1[41]和TA2[42]，多巴胺受体DOP1、DOP2和DOP3[43]。OA1和DOP2偶联Gs和Gq蛋白，引起胞内cAMP和Ca2+浓度上升[38, 43]；OA2B2和DOP1偶联Gs蛋白，引起胞内cAMP浓度的上升[39, 43]；OA3、TA1和DOP3偶联Gi蛋白，导致胞内cAMP浓度下降[40-41, 43]；TA2偶联Gq蛋白，引起胞内Ca2+浓度上升[42]。生物胺不仅在神经调控中发挥重要作用，而且参与免疫反应[44-45]。免疫荧光显示，生物胺受体OA1、TA2和DOP1在二化螟的血细胞上有表达[38, 42, 46]。一系列研究发现，OA可能通过OA1受体调控血细胞的延展和吞噬[38]，TA可能通过TA2受体调控血细胞的延展[42]，而DA可能通过DOP1受体调控血细胞的吞噬[46]。通过转录组测序，在二化螟中鉴定到了12个烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)，其中，α型9个、β型3个[47]。GABA受体是重要的农药靶标之一，研究人员在二化螟中克隆和分析了GABA受体的2个亚型RDL1和RDL2，将其在爪蟾卵母细胞(Xenopusoocytes)中表达，发现第2个跨膜区的2’位置的丝氨酸能影响RDL对地特灵的敏感性，但不会影响对氟虫腈和氟雷拉纳的敏感性[48]。在昆虫中，神经肽通过特异地结合其神经肽受体调控生理与行为过程，研究人员在二化螟中鉴定到了43个神经肽基因和51个神经肽受体基因，并借助定量PCR分析了这些基因在中枢神经系统、脂肪体、肠道和血细胞中的表达，发现大部分均在神经系统显著高表达[49]。

5 二化螟嗅觉相关基因

二化螟触角的转录组测序鉴定了嗅觉相关基因，包括47个气味受体(ORs)、20个离子通道型受体(IRs)、20个气味结合蛋白(OBPs)、4个信息素结合蛋白(PBPs)、2个一般气味结合蛋白(GOBPs)、21个化学感受蛋白(CSPs)和2个感觉神经元膜蛋白(SNMPs)[8]。后来，从二化螟的基因组数据中，研究人员又鉴定出15个新的OBPs[50]。荧光竞争结合试验发现，OBP8对β-紫罗酮、橙花叔醇、法尼醇和2-已酮有很强的结合亲和力[50]，GOBP1对法尼醇和油酸有很强的结合亲和力，而GOBP2对雪松醇、法尼醇、月桂烯、β-紫罗酮和亚麻油酸有很好的结合亲和力[51]。通过在爪蟾卵母细胞(Xenopusoocytes)中表达，发现PBP能增强信息素受体(PRs)对性信息素的敏感性[52]。借助CRISPR/Cas9技术，研究人员成功构建了PBP1和PBP3的敲除突变体[3]，这也是在二化螟中首次通过CRISPR/Cas9实现基因突变。通过自交得到PBP1和PBP3的纯合突变体，触角电位反应(EAG)试验显示，PBP1的纯合突变体对性信息素的电生理反应比PBP3降低得更多，表明PBP1可能扮演着更加重要的作用[3]。

6 二化螟miRNA

miRNA是一类小的、非编码的RNA，通过降解mRNA的转录或抑制翻译下调其靶标基因，主要作用于其转录本的3’端[53]。通过小RNA测序，在二化螟中鉴定到300个miRNA，芯片分析表明,在变态发育过程中有54个差异表达的miRNAs[54]。靶标预测和体外的双荧光素报告试验显示，有7个miRNA(miR-9b、novel-260、Bantam、novel-154、novel-80、novel-89和novel-257)协同调控蜕皮激素合成通路中的3个Halloween基因(Neverland，Disembodied和Spook)，过表达这7个miRNA会降低20-羟基蜕皮激素(20E)的滴度，导致二化螟死亡率上升和发育迟缓，说明通过20E处理可以进行拯救[54]。通过人工miRNA表达技术，将13个新型的二化螟内源miRNA在水稻中过表达，喂食试验显示，其中2个miRNA能够显著地抑制二化螟幼虫的生长，当幼虫持续取食过表达miR-15的转基因水稻，其化蛹时间推后了4 d[55]。另外，在二化螟中鉴定到一个昆虫特有的miRNA(miR-14)，预测其靶标基因为蜕皮激素信号网络中的2个关键基因Spook和蜕皮激素受体(EcR)，双荧光素报告试验表明，miR-14与Spook和EcR存在互作关系，miR-14在二化螟每个幼虫龄期的末段高表达，且与2个靶标基因的表达负相关[56]。在5龄幼虫中注射miR-14的类似物，会引起二化螟致死和畸形现象。将miR-14转到水稻中，喂食试验显示，表达miR-14的转基因水稻对二化螟有很高的抗性[56]。这些研究表明，miRNA可作为害虫防治的潜在靶标，而且，将昆虫特有的miRNA用于害虫治理，也可回避对非昆虫物种的伤害。

7 二化螟热休克蛋白

热休克蛋白(HSPs)是细胞或生物体受到环境胁迫或有害刺激后合成的一类遗传上高度保守的蛋白，参与蛋白质的合成、折叠和转运等，发挥分子伴侣的作用[57]。根据分子量不同，热休克蛋白可分为热休克蛋白90(HSP90)、热休克蛋白70(HSP70)、热休克蛋白60(HSP60)和小分子热休克蛋白(sHSP)[57]。非滞育的二化螟幼虫在冷刺激下，hsp90的表达水平上升[58]，从28～-14 ℃梯度降温处理滞育的二化螟幼虫，发现hsp90的表达量在0 ℃时最高[59]。二化螟hsp70基因能被热胁迫诱导表达，幼虫血淋巴细胞中的hsp70基因在36 ℃时mRNA表达水平最高，且其蛋白表达水平与mRNA表达水平一致[60]。二化螟5龄幼虫在28～39 ℃处理下，hsp60基因能被热胁迫诱导表达，且在36 ℃时mRNA和蛋白表达水平均最高[61]。Lu等[62]检测了二化螟hsp90、hsp70和hsp60的时空表达，发现均在后肠表达量最高、在前肠表达量最低，且在头部表达均较高。hsp90和hsp70在二化螟不同发育时期均有表达，而hsp60在雌成虫中的表达量显著高于雄成虫[62]。hsp90、hsp70和hsp60对热胁迫的敏感性均高于冷胁迫，分别在42、36、36 ℃表达量最高[62]。Lu等[63]和Pan等[64]在二化螟中克隆分析了7个sHSP，包括hsp19.8、hsp21.4、hsp21.5、hsp21.7a、hsp21.7b、hsp22.9b和hsp24.3，其中hsp19.8、hsp21.5、hsp21.7a和hsp21.7b在马氏管或后肠表达量最高，hsp21.4在头部高表达[63]，hsp22.9b和hsp24.3在脂肪体表达最高，在后肠和马氏管表达最低[64]。hsp19.8、hsp21.7b、hsp22.9b和hsp24.3均能被热胁迫和冷胁迫诱导，hsp21.5可以被冷胁迫诱导，而hsp21.4和hsp21.7a对热胁迫和冷胁迫均无响应[63-64]。

8 二化螟被二化螟盘绒茧蜂调控

二化螟盘绒茧蜂Cotesiachilonis是二化螟幼虫期的优势寄生蜂，对二化螟的田间防控作用明显[65]。二化螟盘绒茧蜂寄生能引起二化螟幼虫血细胞数量、延展、存活、吞噬、包囊，以及血淋巴酚氧化酶活性等的变化[1]。Teng等[66]发现，血细胞总数在被寄生的二化螟幼虫后期比未寄生的更高，而血细胞死亡率、浆细胞和颗粒细胞的比例均不受影响。二化螟盘绒茧蜂整个发育期，二化螟血细胞的延展都能被寄生显著地抑制，二化螟盘绒茧蜂寄生可以在早期抑制二化螟的包囊反应和黑化[66]。二化螟盘绒茧蜂的毒液不能直接改变二化螟的细胞免疫反应，但可以通过降低黑化抑制二化螟的体液免疫。与毒液相比，二化螟盘绒茧蜂的萼液对血细胞延展、包囊和黑化有显著作用。剂量注射试验显示，毒液和萼液协同作用比单一使用可以更强更持久地控制二化螟的免疫反应[66]。转录组测序发现，二化螟盘绒茧蜂寄生能影响二化螟脂肪体和血细胞的基因表达，其中，8 096个脂肪体基因和5 743个血细胞基因表达下调，2 572个脂肪体基因和1 452个血细胞基因上调，且大部分差异表达基因与酶活调控、转录调控和催化活性等有关[7]。

9 展望

近年来，二化螟生理生化与分子生物学领域取得了较大的进展。二化螟数据库ChiloDB的构建，为二化螟研究提供了开放的数据平台。利用RNAi技术，许多基因的功能被鉴定解析，使得探讨其作为靶标在防治二化螟中的作用成为可能。一些特定miRNA的转基因水稻对二化螟有很高的抗性，这为防治二化螟提供了新的思路。借助CRISPR/Cas9技术，研究人员成功构建了二化螟的突变体。随着高通量测序和分子生物学技术的不断成熟，二化螟生理生化与分子生物学研究将不断深入，将有更多的功能基因和分子调控机制被解析，这些进展也将会为防治二化螟提供新思路和新手段。