四季草颗粒纯化工艺改进研究

庞秀清，李勇军，何迅

（1.贵州医科大学·贵州省药物制剂重点实验室，贵州贵阳550004；2.贵州省食品检验检测所，贵州贵阳550004）

四季草颗粒已上市销售多年，用于治疗泌尿系统疾病，疗效显著[1－2]。原生产工艺为水煮醇沉工艺，乙醇用量较大，工艺耗时较长，能耗大，有效成分损失也较为严重，可能会影响其疗效。吸附澄清剂纯化中药提取液是近年发展起来的一种新技术[3]，具有用量少、工艺简单、天然无毒、成本低、有效成分损失少等优点，已广泛用于中药提取纯化工艺研究。本研究中采用吸附澄清工艺代替传统工艺用于四季草颗粒工艺改进，不仅克服了传统工艺的弊端，同时对中药民族药资源的研究开发也起到了探索和示范作用。现报道如下。

1 仪器、试药与动物

1.1 仪器

LC－10Avp型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；WML色谱工作站（广西威玛龙色谱科技公司）；AE240型电子天平（十万分之一，梅特勒－托利多仪器上海有限公司）。

1.2 试药

槲皮苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号为111538－200403）；四季红Polygonum capitatum D.Don，车前草Plantago asiatica药材购于贵阳市药材市场，由贵阳医学院药物研究开发中心生药学研究室（中药民族药标本馆长）龙庆德教授鉴定，符合相关规定，均为正品[1，4－6]；壳聚糖（浙江玉环县海洋生物化学有限公司）；ZTC1＋1天然澄清剂（天津振天成科技有限公司）；101果汁澄清剂（上海沃逊生物工程有限公司）；明胶（上海鲁博明胶有限公司）；果胶酶（杰诺生物酶公司）；甲醇为色谱纯（美国Tedia公司），水为纯净水；甲睾酮片（天津飞鹰制药有限公司，批号为0804002）；前列康(浙江康恩贝制药股份有限公司，批号为081028)；消痔灵(北京双鹤高科天然药物有限公司，批号为090705)。

1.3 动物

昆明种小鼠40只，体质量18～22 g，雌雄兼用，动物合格证号为云动管9806号。将小鼠随机分为4组，各10只。

2 方法与结果

2.1 槲皮苷含量测定[7－11]

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Waters C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇－0.1%磷酸（38∶62）；流速：1 mL／min；检测波长：360 nm；柱温：35℃。理论板数按槲皮苷峰计算应不低于5 000。在该色谱条件下，按2005年版《中国药典(一部)》附录ⅥD中高效液相色谱法测定，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.1.2 溶液制备

称取槲皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为50 μg／mL的溶液，摇匀，即得对照品溶液。按处方比例称取经粉碎成粗粉的四季红和车前草，加水煎煮3次（12倍、8倍、8倍），滤过，合并滤液，浓缩至1∶6[药材(g)∶药液(mL)]，备用，即得四季草颗粒提取液；精密吸取试验样品适量，用滤膜（0.45 μm）滤过，即得供试品溶液。

2.2 吸附澄清剂选择[12－13]

取样品提取液，均分为7份，1份取样测定槲皮苷的含量，其余6份分别按比例加入101果汁澄清剂、壳聚糖、ZTC1＋1、明胶、果胶酶5种常用吸附澄清剂，搅拌，静置过夜，抽滤，量取滤液体积，分别取样测定槲皮苷含量和总固体物。以槲皮苷转移率和总固体收率为评价指标进行评价，水煎药液槲皮苷提取率为63.15%，总固体收率为16.75%。结果见表1。可见，以壳聚糖为吸附澄清剂的澄清效果最好，故选择壳聚糖作为四季草颗粒水提液的吸附澄清剂。

表15 种不同吸附澄清剂筛选试验结果（%，n＝3）

2.3 正交试验设计

2.3.1 因素水平表

根据上述试验结果，用壳聚糖处理综合效果较好，故采用正交试验对其吸附除杂的影响因素进行考察。通过预试验，药液的浓缩比例（因素A）、吸附澄清剂加入量（因素B）、药液的pH（因素C）是影响其吸附效率的主要因素[7]。正交试验设计因素水平见表2。

2.3.2 指标选择

采用综合评分法，以槲皮苷和总固体物转移率为评价指标进行评价，权重系数分别为0.8和0.2。综合评分值＝(槲皮苷转移率／最大槲皮苷转移率)×80＋(总固体转移率／最大总固体转移率)×20。结果见表3。

表2 L9（34）正交试验因素水平表

2.3.3 方差分析

由表4可知，三因素均有显著性差异（P＜0.05）；在所选因素范围内，各因素作用主次顺序为A＞C＞B。最佳工艺条件为A3B2C2，即药液浓缩至1∶8[生药(g)∶药液(mL)]，pH＝4，每升药液加入1%壳聚糖冰醋酸溶液100 mL。静置24 h，抽滤，收集滤液，备用。

表3 L9(34)正交试验安排及结果

表4 方差分析结果

2.4 原纯化工艺与新纯化工艺比较

结果见表5。四季草颗粒药材水煎煮液采用壳聚糖吸附纯化，槲皮苷损失较小；采用乙醇沉淀处理，槲皮苷损失较大；2种处理方法所得总固体物和水煎液比较均降低了约35%，达到了试验目的。采用壳聚糖处理，避免了使用大量乙醇，有利于安全生产。

表5 原工艺与新工艺研究结果（%，n＝3）

表6 对甲睾酮引起小鼠前列腺增生的影响（n＝3）

表7 对消痔灵引起小鼠前列腺炎的影响（n＝3）

2.5 原纯化工艺与新纯化工艺样品药效学比较

取2.4项下所得样品，加入蒸馏水配制成溶液。以0.35 g／kg的剂量进行药效学试验，考察四季草颗粒对甲睾酮所致小鼠前列腺增生，对消痔灵所致小鼠前列腺炎的影响[14－16]。实验过程中，模型组死亡1只，原工艺组死亡2只，新工艺组死亡1只。结果见表6和表7。与模型组比较，四季草颗粒新工艺组、原工艺组前列腺质量及前列腺指数明显降低（P＜0.01，P＜0.05），但无显著性差异（P＞0.05）。与模型组比较，四季草颗粒新工艺组、原工艺组前列腺质量及前列腺指数明显降低（P＜0.01，P＜0.05），但无显著性差异（P＞0.05）。

3 讨论

预试验时，为保证吸附澄清剂在试验过程中能发挥各自的优点，故再进行正交试验，进一步优化工艺条件，以期得到最佳吸附澄清工艺。选择处方主药四季红中含量较高的槲皮苷为考察指标能较客观地评价该新工艺，同时，经过对新工艺、原工艺所制备样品进行药效学比较试验，发现2种工艺的药物效应并无显著性差异，进一步证明了该工艺的可行性，达到了多方面客观评价的要求。

该工艺的改进不仅可以节省能源，保护环境，还可以提高经济效益。吸附澄清剂用于中药制剂的纯化工艺已有报道，本研究中尝试将其用于多种药材提取液的纯化工艺中，结果适用于很多药材，但是不适用于含糖量较高的中药材。

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