柴胡皂苷D对骨肉瘤143B细胞增殖抑制作用研究

杨春艳，范文翔，欧学兰，袁斌

（川北医学院药物研究所·川北医学院药学院，四川南充637000）

骨肉瘤是儿童和青少年常见的骨恶性肿瘤，具有发病率高、转移早的特点。虽然目前采用联合化疗及手术综合治疗后患者的5年生存率提高到60%～70%，但仍有患者效果不佳，复发转移率仍达30%～40%[1]。可供选择的临床化疗药物有限，而且大多数都存在耐药性。柴胡是伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根[2]。其最早收载于《神农本草经》，列为上品，味苦、辛，性微寒，归肝、胆经，具有退热解表、疏肝解郁、升举清气的功效，由柴胡组成的经典古方有数百首[3]。其主要化学成分和生物活性成分为柴胡皂苷（saikosaponins，SS）。柴胡皂苷属环氧醚型五环三萜类齐墩果烷型衍生物，对胃癌、肺癌、前列腺癌及肝癌具有抑制肿瘤增殖、诱导细胞凋亡等抗肿瘤作用[4－7]，而柴胡皂苷应用于治疗骨肉瘤的研究报道极少。本研究中通过研究柴胡皂苷单体柴胡皂苷D(SS－d)对人骨肉瘤143B细胞增殖的影响，为柴胡皂苷单体今后用于骨肉瘤的临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

仪器：荧光CKX41型倒置显微镜（日本Olympus公司）；CO2细胞培养箱（美国Thermo公司）；Spectramax 190型酶标仪(Molecular Devices公司)；Micro17R型高速低温离心机(美国Thermo公司)。

细胞株及试药：143B细胞株（中桥新舟生物科技有限公司）；柴胡皂苷D（中国科学院成都生物研究所）；注射用盐酸多柔比星（海正辉瑞制药有限公司）；DMEM培养基、胎牛血清（Hyclone公司）；骨钙素(OCN)酶联免疫检测试剂盒、碱性磷酸酶(AKP)测试盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂配置及分组

柴胡皂苷D浓度配置：取柴胡皂苷D 13 mg，分别加入166 μL二甲基亚砜(DMSO)溶解，充分混匀，制成终浓度为100 mmol／L的母药溶液，4℃保存备用，使用时加入DMEM培养基，将其稀释至相应浓度，备用。

分组：设置阴性对照组（A组，加入同体积培养液），阳性对照组（B组，加10 μg／mL多柔比星），药物组（C1，C2，C3，C4，C5，C6组，分别加6.25，12.50，25.00，50.00，100.00，200.00 μmol／L柴胡皂苷D）。

1.2.2 试验方法

细胞培养：143B细胞体外培养于含10%胎牛血清、100 U／L青霉素、100 μg／L链霉素的DMEM培养基中，置5%CO2及37℃条件下二氧化碳培养箱中培养。

MTT法测定细胞增殖活性：用培养基调整处于对数生长期的细胞悬液浓度为1×104个／mL，将处于对数生长期的143B细胞按1×105个／mL的密度接种在96孔培养板中，每孔100 μL；37℃培养24 h后加入柴胡皂苷D进行干预，分别设药物组（C1，C2，C3，C4，C5，C6组，柴胡皂苷D梯度浓度为6.25，12.5，25，50，100，200 μmol／L）和对照组（A组，不加药组），10 μg／mL多柔比星组(B组)，每组设3个复孔，继续培养，并于6，12，24，48，72 h后用MTT法检测细胞增殖活性，绘制细胞增殖曲线。

143B细胞生长情况观察：在MTT试验中，加药前后分别用倒置相差显微镜观察不同浓度柴胡皂苷D（6.25，12.5，25，50，100，200 μmol／L）作用不同时间（6，12，24，48，72 h）后，各组培养孔内细胞生长的状况、形状、密度及凋亡的细胞等。

样本中AKP活力检测：将143B细胞以1×105个／mL密度接种于24孔板中，24 h后分别加入含不同药物、不同浓度柴胡皂苷D培养液继续培养，在6，12，24，48 h后吸取1 mL上清液置Ep管中，用离心机离心，吸取上清液保存。按AKP测试盒说明书进行操作，步骤见表1。轻轻振摇检测板，混匀孔板，在520 nm波长下用酶标仪检测各孔的光密度(OD)值。参照试剂说明书计算公式计算AKP活力。

样本中OCN表达检测：按上述操作培养143B细胞，加柴胡皂苷D(终浓度为50 μmol／L)，在药物作用6，12，24，48 h后收集各孔中的培养液，以1 600 r／min的速率离心4 min，收集上清液，并封存于－80℃冰箱。参照骨钙素酶联免疫吸咐(ELISA)检测试剂盒说明，设置空白孔、标准品孔和检测样品孔，按清洗、显色、终止、检测步骤操作，依据标准品的浓度和OD值做标准曲线及其回归方程，计算样品的浓度。

表1 AKP活力检测步骤（ L）

1.2.3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件进行分析。计量资料用均数±标准差（表示，各组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 柴胡皂苷D对143B细胞增殖的抑制

柴胡皂苷D作用143B细胞6 h后，细胞活力显著降低，且随着浓度的增加其生存率逐渐降低，随着时间的增加其生存率有轻微下降。用药6，12，24，72 h后，除6.25 μmol／L浓度组以外，其他药物浓度组与对照组比较差异，均有统计学意义(P＜0.05)。48 h后，所有药物浓度组间差距均有统计学意义(P＜0.05)。24，48 h后，阳性对照药多柔比星也有明显抑制作用，与A组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。48 h后的25 μmol／L浓度组与72 h后的50 μmol／L浓度组细胞活性最低。详见表2和图1。

2.2 柴胡皂苷D对143B细胞中AKP活力的影响

AKP是成骨分化的重要标志之一。由表3可见，柴胡皂苷D对AKP的表达并无明显影响，提示柴胡皂苷D对143B细胞的增殖抑制可能不是由促成骨分化作用造成的。而同一组药物随着时间的变化AKP活力改变也不明显，这可能与药物作用太强导致细胞在6 h时就大量死亡有关。

表2 柴胡皂苷D对143B细胞活力的影响（s，n＝3）

表2 柴胡皂苷D对143B细胞活力的影响（s，n＝3）

注：与对照组相比， P＜0.05。

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图1 柴胡皂苷D对143B细胞的抑制作用

2.3 柴胡皂苷D对143B细胞中OCN含量的影响

由表4可见，柴胡皂苷D作用于143B细胞后，人骨钙素含量均下降，50 μmol／L浓度的柴胡皂苷D作用24 h后人骨钙素含量最低，为（0.59±0.002）ng／mL（P＜0.05）。同一药物组随着时间的变化人骨钙素含量差异较小，可能与细胞大量死亡有关。

2.4 柴胡皂苷D对143B细胞形态的影响

柴胡皂苷D作用于143B细胞后，随着作用时间的延长，浓度的增大，细胞体积明显变小，细胞核变小、固缩，全面皱缩，细胞膜破裂，由此可推断出，143B细胞的凋亡可能由柴胡皂苷D改变细胞膜的通透性而引起。详见图2。

3 讨论

近年来，国内外学者对柴胡皂苷的药理活性研究逐渐增多，已证实了柴胡皂苷在镇静、抗惊厥、解热、抗病毒、免疫调节、抗炎、保肝护肾，以及抗肿瘤等多方面具有良好的药理学作用[8]。研究还表明，柴胡皂苷D是活性最强的单体，其发挥抗肿瘤作用[9]可能与以下几种方式有关：免疫调节作用；抑制肿瘤细胞的分裂与生长；诱导细胞凋亡；抑制肿瘤转移；抑制环氧合酶。柴胡皂苷是柴胡的毒性成分，具有肝毒性，不同产地、不同炮制方法、不同提取方法都对其毒性有影响，这主要是因为其含量不一致造成的。相比于其他抗肿瘤药物的高毒性、耐药性，柴胡皂苷仍具有明显的优势。

表3 柴胡皂苷D对143B细胞AKP活力的影响（s，金氏单位／100 mL，n＝3）

表3 柴胡皂苷D对143B细胞AKP活力的影响（s，金氏单位／100 mL，n＝3）

注：与正常细胞组相比， P＜0.05。

组别正常细胞组柴胡皂苷D（50 mol／L）组6 h 0.86±0.13 1.13±0.01 12 h 1.08±0.02 1.03±0.17 24 h 1.12±012 1.17±0.04 48 h 1.18±0.07 1.22±0.06

表4 柴胡皂苷D对143B细胞人OCN含量的影响[s，ng／mL，n＝3]

表4 柴胡皂苷D对143B细胞人OCN含量的影响[s，ng／mL，n＝3]

注：与正常细胞组相比， P＜0.05。

组别正常细胞组柴胡皂苷D（50 mol／L）组6 h 0.99±0.03 0.73±0.71 12 h 1.34±0.08 0.61±0.08 24 h 1.23±0.001 0.59±0.002 48 h 1.20±0.07 0.66±0.21

图2 加入柴胡皂苷D后的细胞形态变化

本研究中，采用不同浓度的柴胡皂苷D在体外作用于骨肉瘤143B细胞，通过MTT检测法发现柴胡皂苷D对细胞的生长抑制作用强，且呈一定的浓度相关性，但随着时间的变化，作用改变不太明显。显微镜下观察柴胡皂苷D引起细胞形态明显改变，细胞膜出现破裂。这可能与李涛等[10]通过体外研究发现柴胡皂苷D的肝毒性并非简单的诱导细胞凋亡，而是柴胡皂苷D诱导了细胞膜通透性的改变，从而导致细胞坏死这一结论有关。

皂苷类药物还具有较强的溶血作用，这可能与143B细胞快速凋亡有关。为了进一步探究其作用机制，采用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率，考察柴胡皂苷D是否有促凋亡作用及有影响细胞周期的作用，若不具有促凋亡作用，则可进一步进行乳酸脱氢酶释放率试验考察柴胡皂苷D对143B细胞膜的损伤作用。

试验结果显示，经柴胡皂苷D作用后AKP的活力变化较小，而人骨钙素的含量降低说明柴胡皂苷D抑制143B细胞增殖的机制可能与促分化作用关系不大，与肿瘤细胞的凋亡和基因的调控关系很大。已有研究表明，脂肪酸合成酶(FAS)在骨肉瘤组织中过表达，可以作为治疗骨肉瘤疾病的新靶位[11]。有许多体内和体外试验表明，FAS抑制剂能抑制肿瘤生长[12－14]。后续试验可以检测FAS基因的表达情况来验证其作用机制。有学者认为，bcl－2／bax的比值是促使肿瘤细胞凋亡的重要原因，其中bcl－2是抑制凋亡的基因，bax是促进凋亡的基因[15]，可将其作为下一步考察的指标。

综上所述，虽然柴胡皂苷能显著抑制骨肉瘤细胞的增殖，但其主要作用机制还需要试验研究，其在体内的活性情况也有待研究。随着对皂苷抗癌作用研究的深入，有望在中医理论指导下，利用现代分子药理学及分子生物学提取筛选其有效成分，开发出新的抗肿瘤药物。

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