海南野生阿宽蕉根际土壤产纤维素酶放线菌的筛选

徐小雄 冯慧敏 徐云升 孙宏元

摘 要 为从海南野生阿宽蕉居群根际土壤中筛选出具有较高酶活的产纤维素酶的放线菌，并对其进行分子鉴定，从而探索阿宽蕉居群根际土壤产纤维素酶的潜力。从海南不同的野生阿宽蕉居群采集7份根际土壤，采用GA培养基和HV培养基进行选择性分离放线菌，采用刚果红染色法对分离得到菌株进行产纤维素酶活性筛选，并对具有活性的菌株进行16S rRNA鉴定，以确定其分类地位。结果表明：从7份野生阿宽蕉根际土壤中共分离得到210株放线菌。其中，55株菌具有纤维素酶活性，12株菌表现出强活性。16S rRNA基因序列分析结果表明，它们属于放线菌纲下5个亚目6个科8个属，分别为链霉菌属、小单孢菌属、野野村氏菌属、疣孢菌属、戈登氏菌属、假诺卡氏菌属、拟诺卡氏菌属和球孢囊菌属，其中链霉菌属、小单菌属和野野村氏菌属为优势菌属。菌株X2303、X2502和X2733与已知菌的序列相似率最高，分别为98.52%、98.79%和99.11%，可能分别为链霉菌属、戈登氏菌属和疣孢菌属潜在的新分类单元。具有最高纤维素酶活性的菌株X2407为链霉菌，其与Streptomyces iranensis的16S rRNA基因序列相似率最高，为99.64%，具有较高的开发价值和应用前景。所以，海南野生阿寬蕉根际土壤中存在产纤维素酶的放线菌资源，主要以链霉菌为主。阿宽蕉根际土壤中存在一些新的放线菌分类单元。

关键词 香蕉 ；放线菌 ；纤维素酶 ；多样性

中图分类号 S668.1 ；Q936 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.09.012

Abstract Actinobacteria producing cellulase in the rhizospheric soil of Musa itinerans in Hainan was isolated and identified by using 16S rRNA gene sequences to explore potential cellulase resources from those habitats. Seven rhizospheric soil samples were collected from M. itinerans populations in Hainan. GA and HV media were used to isolate actinobacteria selectively. The cellulase-producing activities of the isolated strains were screened and preliminarily identified by using 16S rRNA. The results showed that a total of 210 actinobacterial strains were isolated， of which 55 strains had cellulase activity and 12 strains showed strong activity. The results of 16S rRNA gene analysis showed that these strains belonged to 5 suborders， 6 families and 8 genera. These 8 genera included Streptomyces， Micromonospora， Nonomuraea， Verrucosispora， Gordonia， Pseudonocardia， Nocardiopsis and Sphaerisporangium， of which Streptomyces， Micromonospora and Nonomuraea were dominant cellulase-producing genera. Strains X2303， X2502 and X2733 were similar to the known bacteria in sequence， and their similarities were 98.52%， 98.79% and 99.11%， respectively. The Strains X2303， X2502 and X2733 are potential new taxonomic units for Streptomyces， Gordonia and Verrucosispora， respecitvely. The Strain X2407 belonged to Streptomyces which showed the highest cellulase activity， and it had the highest similarity （99.64%） of 16S rRNA gene sequence to Streptomyces iranensis. It had high value for development and application. Cellulase-producing actinobacteria resources in the rhizosphere soil of M. itinerans in Hainan were mainly under Streptomyces. Some new taxonomic units of actinobacteria were detected in the rhizosphere soil of M. itinerans.

Keywords banana ； actinobacteria ； cellulase ； diversity

香蕉为芭蕉科（Musacase）芭蕉属（Musa L.）大型单子叶草本植物[1-2]，国际粮农组织（Food and Agriculture Organization，FAO）认定其为仅次于水稻、小麦和玉米的第四大粮食作物，也是热带和亚热带地区的重要水果作物，在全球超过130个热带和亚热带国家广泛种植。就我国而言，2015年，我国香蕉种植面积为39.33万hm2，生产总量为1 211万t，年产值达到229亿元[3]。

香蕉具有速生和生物产量高等特点，其茎干数量较多，纤维含量高[4]。但是每年香蕉收获季节，香蕉果实收割后，大量的香蕉茎干被丢弃，当作废物四处堆放，这既造成资源浪费也易带来环境污染[5]。史倩青[6]的研究表明，香蕉茎干中干物质的化学成分主要是纤维素、半纤维素和木质素。其中，纤维素含量为58.5%～76.1%，半纤维素28.5%～29.9%，木质素4.8%～6.13%，由于纤维素、半纤维素和木质素含量高，在自然条件下，香蕉茎干难以被降解[7]。因此，研究筛选出对香蕉茎干具有较强专一性的产酶菌株进行发酵，将可实现香蕉茎干的快速分解和再利用，从而提高丢弃的香蕉茎干纤维资源的再利用率。杨礼富等[8]从23份堆肥、森林表土、蕉园耕作層土和糖水废水污泥样品中分离到纤维素酶高产菌和木质素酶高产菌各2株，并对香蕉茎叶表现出较高的酶活。文少白等[9]从香蕉种植园腐烂的香蕉茎秆中分离到8株具有酶活的菌株。其中，细菌3株，放线菌4株，真菌1株。并认为，自然界中能利用香蕉杆的放线菌、细菌很多，但大多数对香蕉杆纤维素的降解能力不强。施娟娟[10]从腐烂蕉头中分离到4株细菌和2株真菌具有一定的酶活。虽然对香蕉茎干纤维素降解的菌株已有部分研究报道，但是筛选到的菌株较少，专一性不强。

阿宽蕉（Musa itinerans Cheesman）隶属于芭蕉科芭蕉属[11]，是野生香蕉种质，该物种克隆生长势强，容易形成单种群优势群落[12]，是我国分布最广的野生蕉[13]，也是海南分布的唯一野生蕉[14]，并且是热带亚热带次生林的先锋植物[15]。在野生阿宽蕉居群中，茎干枯萎凋亡后只能依赖环境自然降解。根据达尔文进化论中自然选择的原则推测，在野生阿宽蕉居群的根际土壤中可能存在丰富的纤维素酶系，并且这种纤维素酶系可能对香蕉茎干的降解具有较强的专一性。

本研究以海南野生蕉根际土壤放线菌资源为研究对象，通过纯培养和分子生物学手段，探索海南野生蕉居群根际土壤放线菌资源多样性及其纤维素酶应用潜力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样品

7份样品均采自海南省中部地区，所采集的土样均为分布有大片野生阿宽蕉居群的根际土壤。从居群内采集5株间距在2 m以上的野生阿宽蕉的根际土壤，采用抖落法采集根际土壤，将各样品混合后，放无菌的封口袋，低温保存带回实验室，摊开后置于阴凉处自然风干，待用。样品信息见表1。

1.1.2 培养基

（1） 分离培养基

葡萄糖天门冬素培养基（GA）[16]：葡萄糖 2 g，天门冬素 1 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，H2O定容至1L，pH为7.2～7.4。

腐殖酸培养基（HV）[17]：腐殖酸1.0 g，CaCO3 0.02 g，Na2HPO4 0.5 g，KCl 1.7 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，琼脂18 g，H2O定容至1 L，pH 7.2。

GA和HV培养基中添加终浓度为50 mg/L的放线菌酮，重铬酸钾和制霉菌素；复合维生素（每升培养基添加VB2 0.5 mg，VB1 0.5 mg，VB6 0.5 mg，烟酸0.5 mg，肌醇0.5 mg，泛酸0.5 mg，生物素0.25 mg，对-氨基苯甲酸0.5 mg）。

（2） 纯化培养基

ISP2培养基[18]：酵母粉4 g，麦芽浸提物10 g，葡萄糖4 g，H2O定容至1 L，pH 7.2。

（3） 纤维素酶活性筛选培养基

ISP4-CMC-Na培养基[19-20]：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）10 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，（NH4）SO4 1 g，trace salts solution 0.5 mL，定容至1 L，agar 15～20 g，pH 7.2。

Trace salts solution：FeSO4·7H2O 0.1 g，MnCl2·4H2O 0.1 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，H2O定容至100 mL。

1.2 方法

1.2.1 样品预处理

将从不同地方带回的阿宽蕉根际土壤，剔除香蕉根和石头等，摊开置于阴凉处自然风干1周，研钵碾磨成粉末。

1.2.2 分离方法与培养条件

每个样品各称量土壤粉末10 g，放置于无菌干燥的三角瓶中，加入无菌水90 mL，摇匀，盖紧，利用50 Hz超声波处理30 min，得到10-1土壤稀释液。然后用无菌水将10-1土壤稀释液稀释得到10-2、10-3和10-4的土壤稀释液。在室温下静置20 min后，分别吸取每个样品10-2、10-3和10-4的土壤稀释液100 μL，分别涂布于GA和HV培养基上，每个浓度设置3个重复。置于28℃恒温培养箱中培养。

1.2.3 挑菌及保藏

经过4～6周的培养，根据平板上菌落的形态特征简单去重后，选取平板上所有的代表性菌落，在ISP2培养基上采用划线法纯化获得单菌落。

将已纯化的菌株接种到ISP2小斜面培养基，放置于28℃恒温培养箱中培养7 d，待长出发达菌丝体后采用石蜡封口，转移至4℃冰箱中低温保藏。同时，挑取菌株的菌体和孢子于20%甘油管中分散，制成悬液，置于-80℃冰箱中保藏。

1.2.4 纤维素酶活性评价

参照沈雪亮和夏黎明[20]的方法，采用接种环将分离得到的菌株接种到ISP4-CMC-Na培养基中，倒置于28℃培养箱中培养1周左右。待菌落长出来以后，在培养基中覆盖浓度为1 mg/mL的刚果红溶液，15 min后，倒去刚果红溶液，加入浓度为1 mol/L的NaCl溶液，15 min后，再倒去溶液，观察是否产生透明圈，若产生，则说明待测菌可以降解纤维素。测量方法是视菌落边缘到透明圈边缘的距离，菌落边缘到透明圈边缘0.1 cm以内视为无活性，大于等于0.1 cm视为有活性。

1.2.5 16S rRNA基因序列分析

在表现出纤维素酶活性的菌株中，通过形态去重后，选取代表性的菌株进行16S rDNA基因序列分析，使用OMEGA细菌DNA试剂盒（D3350-01）提取待测菌的DNA，为下一步PCR提供模板。

采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）对菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增。PCR扩增反应体系为50 μL，其中50 ng/μL的DNA模板工作液2 μL，10 μmol/L的前后引物各2 μL，2 × Taq Master Mix （Vazyme， P111）25 μL，ddH2O加至50 μL。PCR反应程序设置为：94℃变性1 min，56℃退火1 min；72℃延伸90 s，共30个循环，反应前95℃预变性5 min，循环结束后72℃延伸10 min。PCR产物用1% 的琼脂糖凝胶电泳检测后，直接送华大基因测序。

1.2.6 系统发育分析

测序成功的双向序列用ContigExpress软件进行拼接，随后在Bioedit 7.0中进行手工校对。参考Kim等[21]的方法，将得到的16S rRNA基因序列放在Eztaxon（www.ezbiocloud.net）进行比对，然后从网站数据库下载相似率高的相关菌属的模式菌株（Type strain）的16S rRNA基因序列，随后采用Bioedit 7.0中的Clustal W进行多序列比对，并利用MEGA 7.0采用邻接法构建聚类分析图，初步確定菌株分类归属，推断菌株的系统发育分类地位。

2 结果与分析

2.1 海南野生蕉根际土壤可培养放线菌分离结果

通过菌落形态简单去重后，7个样品共分离得到210株放线菌。其中，从GA培养基中共挑取169株菌，HV培养基中挑取41株菌，GA培养基的分离效果比HV培养基的更好。通过其在ISP2培养基上的培养观察，初步判断，分离得到的210株放线菌中，链霉菌110株，非链霉菌100株。而对各个样品的分离效果来看，来自陵水吊罗山国家级自然保护区的27号样品分离得到的菌株数最多。各个样品在不同培养基中的分离结果和初步判断结果详见表2。

2.2 产纤维素酶菌株多样性及系统发育分析

对分离得到的210株菌株进行纤维素酶活性筛选，结果表明，55株菌表现出纤维素酶活性，占筛选菌株的26.2%。基于16S rDNA基因序列的分析，55株活性菌株分布于放线菌纲下5个亚目、6个科、8个属、22个种。其中，链霉菌为优势菌，共有活性链霉菌21株，它们与链霉菌属内9个种有最近的系统发育关系，占全部分离菌株的10%，占全部具有酶活菌株的38.13%；第二优势菌为小单孢菌，与小单孢菌属内5个种有最近的系统发育关系，占全部分离菌株的5.71%，占全部具有酶活菌株的21.85%；第三优势菌为野野村氏菌，与野野村氏菌属2个种有最近的系统发育关系，占全部分离菌株的2.86%，占全部具有酶活菌株的10.91%。此外，与能产生纤维素酶的菌株具有最近系统发育关系的菌属还包括疣孢菌属、戈登氏菌属、拟诺氏菌属、球孢囊菌属和假诺卡氏菌属，各活性菌株的分类及比例详见表3。

通过与已知数据库的比对还发现，测序的菌株中存在候选新种3个。菌株X2303与Gordonia didemni的16S rRNA基因序列相似率最高，为98.52%；菌株X2502与Streptomyces phaeoluteichromatogenes的16S rRNA基因序列相似率最高，为98.79%；菌株X2733与已知菌Verrucosispora gifhornensis的16S rRNA基因序列相似率最高，为99.11%。

结合16S rRNA基因序列信息对活性菌株的样品来源分析发现，从吊罗山分离的活性菌株中多样性最为丰富，分属于6个属；其次为百花岭和仲田岭，分属于5个属。从所有样品分离到的活性菌株中都鉴定了链霉菌。除田头岭外，其他样品中都鉴定到了小单孢菌。进一步验证了链霉菌和小单孢菌为优势菌属。在所有样品中，百花岭分离到的活性菌株数占总分离菌株数的比例最高，且包含5个菌属，多样性较为丰富。各样品分离到的活性菌株数及其分类详见表4。

基于16S rRNA 基因序列比对结果，选取22个种级类群的代表菌株（包括候选新种）及其最相近的有效发表菌种，构建聚类树（图1）。

2.3 纤维素酶活性评价

在分离到的210株菌种，能产纤维素酶活性的菌株55株。其中，透明圈直径大于1.0 cm的放线菌菌株共12株，占具有酶活菌株的21.82%。菌株X2407产生的透明圈最大，直径达到2.3 cm，如图2。

经过16S rDNA基因序列分析，12株高纤维素酶活性菌株中，链霉菌属Streptomyces 10株，与该属6个种具有最近的系统发育关系，小单孢菌属Micromonospora 1株，野野村氏菌属Nonomuraea 1株，其透明圈大小、分离地点和系统分类地位最近的菌株详见表5。在这10株链霉菌属菌株中，Streptomyces iranensis共4株，且产生的透明圈均较大，最大直径为2.3 cm，最小直径1.3 cm，平均直径1.8 cm。因此推测，Streptomyces iranensis为该生境中产生纤维素酶的优势菌种，可能具有纤维素酶开发与应用的潜力。

3 结论与讨论

阿宽蕉为芭蕉科芭蕉属作物，由于具有较长的根茎，并且克隆生长势强，极易形成大面积的野生居群，是热带亚热带次生林中的先锋植物。由于其保水能力强，生态修复能力好，已成为海南自然保护区和野生林区的重要保护物种。在野生阿宽蕉居群中，香蕉茎秆枯萎后自然降解形成肥沃的土壤。因此推测，其根际土壤菌群中可能蕴藏丰富的待开发利用的纤维素酶资源。

本研究采用稀释涂布法对海南岛内7个野生阿宽蕉居群的根际放线菌进行分离，得到55株具有纤维素酶活性菌株。16S rRAN基因分析显示分属于5个亚目、6个科、8个属、22个种。其中，优势菌属分别为链霉菌属、小单孢菌属和野野村氏菌属，这一结果与张敬等[22]的研究结果基本一致。张敬等对云南东川干热河谷、元谋土林以及昆明周边高温堆肥、热泉等环节可培养高温放线菌的多样性及其产纤维素酶能力进行研究，结果表明，具有高纤维素酶活的菌株中链霉菌所占的比例最大，其次为小单孢菌[22]。而在本研究中，具有高酶活的12株菌株中，链霉菌10株，占高酶活菌株的83.33%。目前的研究表明，链霉菌是分布最广泛，且具有较高酶活及活性的放线菌类群。在本研究和前人的研究中也表明，其在纤维素酶的产生上可能有较高的应用价值，具有开发和应用的潜力。另外，也有研究表明，小单孢菌具有棉花纤维的降解能力[23]。

通过16S rRAN基因分析，本研究得到的具有酶活的55株菌种中，可能存在3个候选新种。其中，菌株X2733与系统发育关系最近已知菌Verrucosispora gifhornensis的基因序列相似率为99.11%；菌株X2502与系统发育关系最近已知菌Streptomyces phaeoluteichromatogenes的基因序列相似率为98.79%；菌株X2303与系统发育关系最近已知菌Gordonia didemni的基因序列相似率为98.52%。下一步将对以上3株菌进行深入研究，已确定其新种的可能性及可能存在的开发潜力。

目前，对香蕉根际土壤微生物的研究还有对其健康栽培地和染病栽培地微生物群落差异的研究方面，而尚未见对香蕉野生居群微生物群落多样性方面的研究。邓晓等[24]对23个香蕉枯萎病发病和不发病土壤样品进行比较发现，发病土壤中可培养放线菌总数为7.48×104，而不發病的为1.99×105。栽培香蕉地土壤中的可培养放线菌数量与土壤的质量呈正相关，进一步研究野生香蕉土壤可培养放线菌的种群结构和数量，有利于下一步利于它们来开发微生物菌肥，进而通过改良发病土壤的放线菌种群结构和数量来改善发病区域不能种植香蕉的状况。此外，Cao等[25]从健康的香蕉根和叶分离得到224株放线菌，绝大多数是链霉菌，其内生链霉菌是控制香蕉巴拿马病的有效潜在生物资源。在本研究中，从野生阿宽蕉根际土壤分离得到的210株放线菌菌株，可以进一步探索其在香蕉种植病原菌的生物防治上的应用，从而为香蕉种植病害的生物防治提供菌种资源。

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