糖与温度对短柄细叶连蕊茶花粉活力的影响

于波 朱玉 黄丽丽 孙映波 吴华玲

摘 要 为了建立短柄细叶连蕊茶（Camellia parvilimba Merr. et Metc. var. Brevipes Chang）花粉检测和低温保存的方法，克服该物种与其他山茶物种间因开花时间与空间不同所造成的杂交育种障碍，开展了糖与温度对短柄细叶连蕊茶花粉活力的影响研究。采用离体萌发法，研究糖的种类（蔗糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖和山梨醇）、濃度（0.146～0.876 mol/L）、低温（5～25℃）或高温（30～35℃）处理以及-80℃低温贮藏对花粉萌发的影响。结果表明：花粉在含有0.292 mol/L的蔗糖或乳糖的培养基中萌发率较高，分别可达16.17%和16.08%。低温处理（5～25℃）对花粉萌发无不良影响，但高温（≥30℃）能造成花粉萌发率显著降低。经30℃处理6 h后，花粉萌发率显著下降至10.20%。花粉在-80℃条件下贮藏12个月后，萌发率仍可达11.12%。本研究为今后利用短柄细叶连蕊茶开展山茶物种间杂交育种，克服花期不遇等问题提供技术参考。

关键词 短柄细叶连蕊茶 ；花粉 ；生活力 ；贮藏力

中图分类号 S685.14 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.09.005

Abstract In order to establish a method for pollen detection and cryopreservation of Camellia parvilimba and overcome the obstacle of cross breeding between Camellia parvilimba and other species due to the difference of flowering time and space， the effect of carbohydrate and temperature on the pollen vigor of C. parvilimba Merr. et Metc. var. Brevipes Chang was analyzed. The effects of carbohydrate （sucrose， lactose， glucose， maltose and sorbitol）， concentration （0.146 ～ 0.876 mol/L）， low temperature （5～25℃）， high temperature （30～35℃） and low temperature storage （-80℃） on pollen germination of C. parvilimba were studied through in vitro germination. The results showed that pollen germination rate was higher in the medium containing 0.292 mol/L sucrose or lactose， up to 16.17% and 16.08%， respectively. Low temperature （5～25℃） had no bad effect on the pollen germination， but the germination rate of pollen decreased significantly under high temperature （≥30℃）. After the pollen was treated for 6h at 30℃， the pollen germination rate dropped to 10.20%. After the pollen was stored for 12 months under -80℃， the germination rate was up to 11.12%.

Keywords Camellia parvilimba ； pollen ； vitality ； storage capacity

连蕊茶组（Sect. Theopsis Coh. St.）是山茶科山茶属重要的一组植物，共49种，我国原产46种[1]。该组植物主要特点：花量大，花朵密集，多数种类具芳香气息[2]；但也有不少缺点：花朵单瓣，花径较小，色泽多为白色，比较单一，且叶片较小较薄，树枝较细偏软等。短柄细叶连蕊茶（Camellia parvilimba Merr. et Metc. var. Brevipes Chang）是连蕊茶组小乔木，产于我国广东和江西[1]，树体玲珑，枝叶稠密，花小秀雅，花瓣背带淡红色可观树、观花，可作花境、花坛、林丛类应用，具有很高的观赏和园林应用价值[3]。

迄今为止，只有少数连蕊茶物种被引种驯化并用于茶花人工杂交育种，包括短柄细叶连蕊茶在内的大多数连蕊茶还未系统地参与茶花的人工育种。因此，利用这些连蕊茶物种资源与茶花品种进行种间杂交，将二者具有的优势性状互补，充分利用杂种优势改良传统茶花，培育特色优良的茶花新品种是今后茶花育种的重要工作。目前，已有川鄂连蕊茶（C. rosthorniana）和毛柄连蕊茶（C. fraterna）的花粉培养与低温贮藏的研究报道[2，4]，但未见短柄细叶连蕊茶花粉生活力和低温贮藏的研究报道。在许多研究报道中，糖和温度是花粉离体萌发的主要影响因素[5-23]。本研究以短柄细叶连蕊茶花粉为试材，研究了糖的种类、低温或高温处理以及-80℃低温贮藏对花粉萌发的影响，旨在为今后利用短柄细叶连蕊茶开展山茶属物种间杂交育种，克服花期不遇等问题提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为短柄细叶连蕊茶，种植于浙江金华国际山茶物种园。采集即将开放，但尚未散粉的短柄细叶连蕊茶的花蕾，置于干燥处12 h，（25±1）℃。待花药打开散粉时，收集花粉。先用镊子将散粉的花药轻轻取下，放在纸片上，干燥处放置24 h，（25±1）℃；然后将花粉连同花药壳一起分装到1.5 mL冻存管中，拧紧管盖，放入-80℃超低温冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 花粉生活力测定

花粉萌发适宜糖类测定：分别将含有0.292 mol/L的糖即蔗糖（100.0 g/L）、麦芽糖（105.2 g/L）、葡萄糖（52.6 g/L）、乳糖（100.0 g/L）和山梨醇（52.6 g/L）的5种固体培养基（8 g/L琼脂，pH 5.5～6.0）加热滴于载玻片上，冷凝后，用无菌牙签将新鲜花粉均匀涂撒在培养基表面。将载玻片置于放有湿润滤纸的培养盒内，然后将培养盒装入塑料自封袋密封，置于生化培养箱内（25±1）℃，培养24 h后，于显微镜下观察拍照和统计，根据萌发率确定花粉萌发的适宜糖类。

花粉萌发适宜蔗糖浓度测定：设计5种蔗糖浓度，分别为0，0.146、0.292、0.584、0.876 mol/L，8 g/L琼脂，pH 5.5～6.0。培养24 h后，于显微镜下观察拍照并统计萌发率，以确定适合短柄山茶花粉萌发的适宜糖浓度。

低温或高温对花粉萌发影响的测定：模拟华南地区冬、春季夜间较低温度（5～20℃）和中午较高温度（25～35℃），将花粉培养分为2个阶段，第一阶段设置7种温度，分别为5、10、15、20、25、30和35℃进行6 h培养处理，模拟夜间低温或中午高温。第二阶段转移至（25±1）℃条件下恢复培养18 h，显微镜下观察统计萌发率，以测试冬春季夜晚低温和中午高温对短柄山茶花粉萌发的的影响。上述试验培养基为0.292 mol/L蔗糖，8 g/L琼脂，pH 5.5～6.0。

统计花粉萌发率时，每个处理3次重复，每个重复观测100粒花粉以上。花粉管长度大于花粉粒直径作为萌发标准。花粉萌发率（%）=萌发花粉数/花粉总数×100%，取平均值作为花粉萌发率。

1.2.2 花粉贮藏力测定

将-80℃超低温冰箱保存0、3、6、9和12个月的花粉，取部分花粉按上述适宜条件进行萌发率测定。

1.2.3 显微观察

花粉萌发观察采用ZEISS正置显微镜（Axio Scope A1，德国）。使用AxioVision软件进行图像捕捉和保存。

1.2.4 统计方法

使用 SAS V8.02软件进行数据分析，采用Duncan's （1955） 多重比较法进行差异显著性测验。

2 结果与分析

2.1 适宜糖类的筛选

浓度为0.292 mol/L（即100 g /L蔗糖当量）的不同糖类对短柄细叶连蕊茶花粉萌发率的影响，见图1～2。结果表明，以蔗糖和乳糖为碳源时，花粉萌发率最高达16.17%和16.08%；无糖和葡萄糖培养基次之，分别为10.39%和9.52%；山梨醇再次之，麦芽糖最次，萌发率仅有3.03%。最高组、次之组和最次之组之间差异显著，即蔗糖和乳糖均是最适宜花粉萌发的碳源供给者。

2.2 适宜糖浓度的筛选

培养基中蔗糖浓度对短柄细叶连蕊茶花粉萌发率的影响，见图3。结果表明，随着蔗糖浓度升高，花粉萌发率先升高后降低，其中当蔗糖浓度为0.292 mol/L时，花粉萌发率最高达16.17%；当蔗糖浓度升高到0.876 mol/L时，花粉萌发受到显著抑制，萌发率仅为3.26%，显著低于对照。显微镜观察结果也证实，当蔗糖浓度为0.292 mol/L时，花粉萌发率最高（图4）。因此，最适宜花粉萌发的蔗糖浓度为0.292 mol/L，即100 g/L。

2.3 低温或高温对花粉萌发的影响

本试验模拟华南地区冬春季温度，对花粉培养分为2个阶段，研究了第一阶段的高温或低温对短柄细叶连蕊茶花粉萌发率的影响（图5～6）。结果表明，将花粉置于5～25℃环境中培养6 h后，再恢复培养18 h，花粉萌发率较高，分别为16.47%、16.59%、15.79%、16.54%和16.17%，差异不显著。随着第一阶段处理温度的升高，花粉萌发率显著降低，当处理温度为30℃时，花粉萌发率降为10.20%；当处理温度升高到35℃时，花粉萌发率进一步降低，仅为1.85%。因此，证实低温对花粉的萌发没有不良影响。

2.4 -80℃貯藏时间对花粉萌发的影响

花粉-80℃贮藏试验，结果见图7，花粉保存前萌发率为16.17%；贮藏3个月后，萌发率为15.57%，但与新鲜花粉萌发率差异不显著；随着贮藏时间延长，花粉萌发率有所下降，贮藏6个月后，花粉萌发率降为12.97%；贮藏9个月后，花粉萌发率为11.73%；贮藏12个月后，花粉萌发率仍然达11.12%，与贮藏6个月后的萌发率差异不显著。

3 讨论

花粉萌发时需要能量物质，花粉自身会贮藏一些淀粉等糖类物质，这些物质能够促进花粉在适宜条件下启动萌发。随着花粉管的伸长，外源的糖类物质将会影响花粉管的生长。花粉培养使用较为普遍的是蔗糖。本研究结果表明，蔗糖与乳糖能较好地促进短柄细叶连蕊茶花粉萌发，效果差异不显著；葡萄糖浓度为0.292 mol/L时，促进花粉萌发效果次之；无糖或山梨醇再次之；麦芽糖最差。前人相似的研究结果表明，蔗糖比果糖和甘露醇更能促进樱桃花粉的萌发[5]；在野生龙蒿萌发试验中，蔗糖优于麦芽糖和葡萄糖[6]。但也有不同结论，陈暄等对茶树花粉萌发的研究表明，麦芽糖优于蔗糖[7]；安国宁等对桃树花粉萌发的研究则发现，葡萄糖优于蔗糖[8]；许珂等对金银忍冬花粉萌发的研究则表明，乳糖优于葡萄糖、蔗糖和果糖[9]。因此，在进行某个物种花粉培养时，要先试验才能确定适宜的炭源。值得一提的是，浓度为0.292 mol/L的无糖或葡萄糖促进花粉萌发的效果差异不显著，表明作为炭源，此浓度的葡萄糖对短柄细叶连蕊茶花粉萌发促进效果不明显；试验中浓度为0.292 mol/L的麦芽糖培养基上的花粉萌发率还不及无糖培养基，表明麦芽糖不仅没有促进作用，还严重抑制了花粉的萌发。

糖不仅提供花粉萌发和花粉管生长所需的能量，其适宜的浓度也能够维持细胞内外渗透压平衡。前人研究结果表明，山茶属多个物种如连蕊茶[3-4]、油茶[10]、红山茶[11-14]、金花茶[15]、茶树[7，16]的花粉体外萌发所需适宜蔗糖浓度在5%～20%（0.146～0.586 mol/L），其中川鄂连蕊茶为20%，毛柄连蕊茶为10%。本研究表明，短柄细叶连蕊茶花粉体外萌发所需适宜蔗糖浓度为10%。因此，进行连蕊茶组物种的花粉培养试验时，也要先试验适宜的糖浓度。

温度对花粉萌发至关重要。许多植物花粉萌发的适宜温度在20～28℃[15-17]；但一些植物花粉适宜萌发温度较高，达30℃[18-19]；而有的植物花粉萌发适宜温度较低，仅为10℃[20]，超过适宜温度的范围，花粉萌发就会受到不同程度的抑制。本试验模拟华南地区冬春季温度，对花粉培养分为2个阶段，第一阶段设置了7种温度，培养6 h后，再转移至25℃恢复培养，主要目的是为了研究第一阶段的高温或低温对长柄山茶花粉萌发率的影响。结果表明，第一阶段5～25℃的培养，花粉萌发率较高，且差异不显著，表明低温对花粉萌发率没有不良影响。而第一阶段培养温度达到30～35℃，花粉萌发率明显降低。因此，在华南地区冬春季进行茶花杂交授粉时，不必担心夜间低温对花粉萌发的影响；但要充分考虑中午高温对花粉萌发的影响。

花粉保存通常分为冷藏（4～5℃）、低温（-80～-20℃）和超低温（液氮-196℃）保存等几种方式。一般来说，冷藏保存可短期内保持花粉活力[3]；低温保存可较长时间保持花粉活力[21-22]；超低温保持可长期保持花粉活力[23]，但成本较高。本研究在-80℃保存1年后，短柄细叶连蕊茶的花粉萌发率仍然达到10%以上，可以解决花期不遇的问题，满足杂交授粉对花粉活力的需求。

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