水热法提取龙井长叶中茶多糖工艺优化研究

周宇波，李霞飞，高岳芳*，肖 斌，杨亚军,2*

(1.西北农林科技大学 园艺学院，陕西 杨陵 712100；2.中国农业科学院 茶叶研究所，浙江 杭州 310000)

我国是主要茶叶生产国，茶园总面积居世界第一。然而我国茶叶生产总值并不高，其中一个主要原因是在茶叶的生产加工过程中，大量粗老枝叶和茶叶灰末等副产品常被丢弃，造成了自然资源的巨大浪费。研究发现茶多糖在成熟叶片中的含量比嫩芽中高[1]，并且茶多糖的生物活性也得到了广泛关注与研究[2-6]，为茶树叶片的高值化利用开辟了一条新的途径。

目前茶多糖的提取方法很多，Y.F.Wang[7]等采用热水浸提法对茶花中多糖进行了提取纯化；何晓梅[8]等采用酶法辅助提取低档绿茶多糖，并对其抗氧化活性进行了研究；李继伟[9]等利用响应面法优化了微波辅助下绿茶多糖提取工艺条件；高仁金[10]等采用超声波辅助酶法对茶叶废料中茶多糖进行提取。这些提取方法同样适用于其他样品多糖的提取，如张强[11]等采用超声波辅助法提取南瓜叶多糖，并对其抗氧化活性进行研究；刘婷[12]等使用超声波法对西洋参多糖的提取工艺进行研究；常昕[13]等采用水提醇沉法对博湖蘑菇多糖提取工艺进行优化。其中热水浸提法是多糖类提取最常用的方法，但却鲜有提及水热法在多糖提取中的应用。

水热法是指在密封的压力容器中，以水为溶剂，在高温高压的条件下进行反应，多应用于纳米材料的合成制备[14-17]。在密闭反应体系中水受热变成蒸汽并形成一定的压强，茶叶中纤维素、半纤维素等的碳链发生裂解，形成分子质量更小的水溶性多糖。水热法不需要添加其他化学物质或酶制剂，生产设备也比微波法和超声波法简单，更适合于工业化生产。

本试验将水热法应用于茶多糖的提取，并结合提取温度、料液比、提取时间3个因素研究茶多糖提取得率。运用单因素试验和正交试验优化提取工艺，为茶多糖的提取提供崭新的思路与试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

龙井长叶，陕西省汉中市南郑县牟家坝镇何氏家庭农场多年生茶园的成熟叶片。试验所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

MC-MRH-100高温高压反应釜(北京满仓科技有限公司)；FW-400AD高速万能粉粹机(天津鑫博得仪器有限公司)；80目标准检验筛(浙江省上虞市大亨桥化验仪器厂)；AL204电子分析天平(梅特勒-托利多有限公司)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；WFZ UV-2102C紫外可见分光光度计(尤尼柯仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 粗多糖提取 将茶树叶片于80℃下烘干、粉碎、过80目筛。准确称取茶粉2 g，并使用搅拌提取的方法，在转速400 r·min-1条件下，利用高温高压反应釜对茶多糖进行水热提取。

1.3.2 粗多糖得率测定 将提取液真空抽滤、弃残渣，滤液定容至250 mL，定容后的溶液使用苯酚硫酸法[18]在490 nm处测定吸光度值。根据葡萄糖标准曲线得出多糖浓度，再代入多糖得率公式，即得到茶多糖得率。

1.3.3 葡萄糖标准曲线的绘制 精确称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖标准品100 mg，用蒸馏水溶解后定容至100 mL容量瓶中，再吸取该溶液10 mL至100 mL容量瓶中，即得到葡萄糖标准溶液。精确量取0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL和1.0 mL的葡萄糖标准溶液，补水至1.0 mL，配制成0、20、40、60、80 μg·mL-1和100 μg·mL-1的葡萄糖标准待测液。在葡萄糖标准待测液中加入1.0 mL 5%苯酚溶液，混匀后再加入3.5 mL浓硫酸，充分混匀，静置20 min后在波长490 nm处测定吸光度值，以葡萄糖质量浓度x为横坐标、吸光度值y为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线(图1)。

1.3.4 水热法提取

1.3.4.1 单因素试验 1)不同料液比处理：准确称取已预处理的茶叶粉末2.0 g，分别按料液比1∶15、1∶20、1∶25和1∶30(g·mL-1)于120℃下浸提60 min。2)不同浸提温度处理：准确称取已预处理的茶叶粉末2.0 g，在料液比1∶20条件下，分别于100、120、140℃和160℃条件下浸提60 min。3)不同浸提时间处理：准确称取已预处理的茶叶粉末2.0 g，在料液比1∶20(g·mL-1)、120℃条件下，分别浸提30、60、90 min和120 min。

1.3.4.2 正交试验 在单因素试验基础上，以粗多糖提取率为考察指标，用正交试验L9(33)优化龙井长叶中茶多糖水热法的提取工艺，设置因素水平(表1)。

表1 因素与水平

1.3.5 样品的测定 吸取样品液0.1 mL，补水至1 mL，加入5%苯酚1 mL混匀后再加3.5 mL浓硫酸充分混匀，静置20 min后于490 nm下测定吸光度。由回归方程求出其浓度。根据浓度和稀释倍数计算茶多糖得率。公式即：

(1)

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

图1为葡萄糖标准溶液在波长490 nm下建立的标准曲线图，标准曲线为y=0.013x-0.001,R2=0.999。表明在0～100 μg·mL-1的葡萄糖浓度范围内，质量浓度与吸光度值呈良好的线性关系。

2.2 水热法单因素试验结果

2.2.1 提取温度对茶多糖得率的影响 由图2可知，随着温度的升高，茶多糖提取率先增加后减少，在120℃时达到最大值108.26 mg·g-1，之后随着温度的提高，得率下降。说明提取温度升高对茶多糖得率的升高作用有一定的限度，到达极限后再升高温度，反而会使茶多糖得率降低。因此当茶粉质量为2 g，提取时间为60 min，固液比为1∶20时，最佳提取温度为120℃。

图1 葡萄糖标准曲线

图2 提取温度对茶多糖得率的影响

2.2.2 提取时间对茶多糖提取率的影响 由图3可知，随着提取时间的增加，提取率先略有升高再降低，当提取时间为60 min时，茶多糖得率最高，为109.75 mg·g-1，之后增加提取时间反而导致得率下降。说明提取时间的延长对茶多糖得率的升高作用有一定的限度，到达极限后再增加提取时间，反而会使茶多糖得率降低。因此当茶粉质量为2 g，提取温度为120℃，固液比为1∶20时，最佳提取时间为60 min。同时发现，当提取时间为90 min时，得率下降并不明显，可知提取时间对多糖得率的影响并不明显。

2.2.3 固液比对茶多糖提取率的影响 由图4可知，随着固液比的增加，茶多糖提取率先增加后又减少，且在1∶20时，得率最高，达到108.45 mg·g-1，说明液料比升高对茶多糖得率的升高作用有一定的限度，到达极限后再升高液料比，反而会使茶多糖得率降低。因此当茶粉质量为2 g，提取温度为120℃,提取时间为60 min时，最佳提取固液比为1∶20。

2.3 正交试验结果

由表2中极差R值可得，影响茶多糖得率的主次因素顺序为：提取温度>固液比>提取时间，水热法提取茶多糖的最佳工艺组合为A3B2C3，即提取温度120℃、提取时间90 min、固液比1∶25(g·mL-1)。

图3 提取时间对茶多糖得率的影响

图4 固液比对龙井长叶中茶多糖得率的影响

编号因素提取时间/min提取温度/℃固液比/(g·mL-1)得率/(mg·g-1)1301001∶1512.602301201∶2099.113301401∶2597.504601001∶2068.845601201∶25100.726601401∶1574.997901001∶2595.468901201∶1597.489901401∶2089.41K169.7358.9761.69K281.5299.1086.04K394.1287.397.89R24.3940.1336.20优水平A3B2C3主次因素BCA

2.4 验证试验

由表3可知，按照正交试验优化得到的最佳提取工艺条件，即提取温度120℃、提取时间90 min、固液比1∶25 (g·mL-1)。平行做了3次试验，茶多糖得率达到(110.23±0.49)mg·g-1，高于正交试验表中各试验的结果，且该工艺重现性好，结果可靠。

表3 验证试验结果

3 结论与讨论

本研究采用水热提取法对龙井长叶中茶多糖进行提取，运用苯酚-硫酸法测定茶多糖得率，并在单因素试验的基础上，通过正交试验优化，得到水热法提取龙井长叶中茶多糖的最佳工艺条件为：提取温度120℃，提取时间90 min，固液比1∶25 (g·mL-1)，多糖得率为110.23 mg·g-1。

池爱萍[19]等以紫阳富硒茶为原料，采用传统热水法，对经过80%乙醇沉淀后的茶渣用80℃热水浸提4 h，茶多糖得率为3.97%，低于本试验中最佳得率110.23 mg·g-1。郭艳红[20]等采用酶法，结果表明质量分数0.8%的茶叶水解酶，在pH 5.5，温度48℃的条件下，茶多糖含量最高，得率为2.01%，同样低于本试验的110.23 mg·g-1。本试验中茶多糖得率相对于传统热水浸提法和酶提取法较高的原因，一方面与使用水热法有关，当温度高于100℃时，水受热形成蒸汽使细胞壁中纤维素、半纤维素等亲水性成分和一些分子量较大的多糖充分发生裂解，而且加速了其形成水溶性多糖的时间。另一方面可能与试验中使用搅拌提取有关，搅拌可以提高反应体系的传质速率，缩短反应时间，加快多糖的溶出。因此本试验的提取时间不仅远低于传统热水提取法的浸提时间，还低于酶解法。此外茶多糖的提取率及影响茶多糖提取率的因素主要与茶叶的品种、年龄、生长环境、加工状态、所在器官部位等多种因素有关[21]，这些因素不同也会导致得率的差异。

本试验使用水热法提取茶多糖，为茶多糖的高效、高得率的提取开辟了崭新的途径，进一步开展茶多糖的纯化，结构鉴定和生物活性等方面的探索与分析，将为茶多糖工业化提取及茶多糖在药品、食品等领域的开发提供技术指导。

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