楚雄腮扁叶蜂危害诱导松针挥发性物质的成分分析

陈 敏，刘方炎，李永和，史敏锐，朱正仓

(1.西南林业大学 生命科学学院，云南 昆明 650224；2.中国林业科学研究院 资源昆虫研究所，云南 昆明 650224；3.西南林业大学 云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南 昆明 650224；4.西南林业大学 林学院，云南 昆明 650224)

云南松(Pinusyunnanensis)是我国西南地区极为重要的经济树种。其起源和分布中心均在云南高原，分布范围延伸到西南季风影响下的西藏、四川、云南、贵州和广西等省区。云南松是云南省主要森林树种，分布面积极广，约占全省森林面积的70%，海拔700～3 200 m均有分布。楚雄腮扁叶蜂(Cephalciachuxiongica)隶属于膜翅目(Hymenoptera)扁叶蜂科(Pamphiliidae)腮扁叶蜂属(Cephalcia)，是云南松和华山松(P.armandii)等松科植物的重大食叶害虫。楚雄腮扁叶蜂虫害大面积发生时，被害林针叶常被全部吃光，林分远看形似火烧。目前，其对云南省松林的危害程度仅次于松毛虫。在正常生理状态下，不同种类的植物均能主动产生并释放特定的挥发性物质，这些挥发物组成了该种植物特有的气味特征主体，从而为植食性昆虫的产卵、逃避和取食等行为提供了有价值的信息[1]。但昆虫取食会改变植物释放的挥发性物质的成分和含量[2-3]。植物释放的挥发物常常被有害昆虫用作区分植物的种类，即寄主或非寄主植物，以及判断已在该植物上取食的昆虫密度[4-5]。植物释放挥发性物质的组分和含量受到多种因素的影响，包括植物种类、发育阶段以及受害部位、程度和持续时间等。通常，植物在受到机械损伤后释放的挥发性物质对植食性昆虫天敌具有引诱作用，但这种引诱作用持续时间很短，在损伤形成后很快消失。但植食性昆虫的取食活动对寄主植物造成的损伤与机械损伤完全不同，它不仅能诱导植物产生并释放大量新的挥发物成分，从而增强对昆虫的引诱作用，而且释放的新的挥发物成分持续相当长时间。目前，已有学者对不同地区健康植株或部分昆虫危害的云南松松针挥发性物质主要成分进行了研究[6-8]。但有关楚雄腮扁叶蜂不同危害程度下云南松松针挥发性物质成分变化尚未见报道。本研究对云南省寻甸县楚雄腮扁叶蜂危害的云南松松针挥发性物质进行了研究报道，初步掌握了不同危害程度下，云南松松针挥发性物质主要成分及差异，为防控楚雄腮扁叶蜂危害的大面积发生提供理论基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 云南松松针挥发性物质的提取

2016年10月在云南省寻甸县(25°18′N，103°12′E；海拔1 970 m)云南松纯林中，选择受楚雄腮扁叶蜂取食为害的林地进行取样。云南松植株受危害程度的判定标准为：严重危害，即云南松植株约50%的松针枯黄，楚雄腮扁叶蜂虫巢数>10个；中度危害，即云南松约30%的松针枯黄，虫巢数5～10个；轻度危害，即云南松约10%的松针枯黄，虫巢数<5个；健康植株，即云南松松针正常，无枯黄现象，无虫巢。

松针挥发物质提取采用水蒸气蒸馏萃取法。取新鲜健康和不同危害程度的松针各100 g，剪碎后分别放到1 000 mL的蒸馏瓶中，加400 mL蒸馏水，水蒸气蒸馏4 h。馏分用乙醚萃取，无水硫酸钠干燥24 h。从不同处理材料中分别取1 μL提取的松针油进行质谱分析。

1.2 挥发性物质含量的测定

松针提取物分析测试在TRACE DSQ GC/MS联用仪上进行，进样量为1 μL。

GC条件：色谱柱为DB-17(30.0 m×250 μm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱，柱温40℃(保留3 min)，40℃·min-1升温到130℃，2℃·min-1升温到160℃，20℃·min-1升温到280℃，保持3 min。汽化室温度230℃；载气为高纯He(99.999%)；柱前压35.03 kPa，载气流量1.0 mL·min-1；进样量1 μL；分流比40∶1。

MS条件：离子源为EI源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压1 982 V；接口温度280℃；质量扫描范围10～450 amu。

1.3 数据处理

通过HPMSD化学工作站数据处理系统，利用色谱峰面积归一法，测得各化学组分在挥发油中的百分含量，再经GC-MS测定，运用NIST质谱数据库进行自动检索、解析，确认其化学成分，并在计算机检索的基础上进行人工识别和判读。

2 结果与分析

2.1 松针挥发物质总离子流

从云南松健康松针和不同危害程度松针总离子流图可以看出，健康云南松松针和受到楚雄腮扁叶蜂不同危害程度松针挥发油的总离子流图色谱峰存在明显差异(图1～图4)。从云南松健康松针挥发油的总离子流图中可检测出约17个色谱峰，鉴定出16种化合物，所鉴定的成分约占挥发性物质色谱峰面积的97.58%。从严重危害的松针挥发油中可检测出约15个色谱峰，鉴定出14种化合物，所鉴定的成分约占挥发性物质色谱峰面积的97.27%。从中度危害的松针挥发油中可检测出约19个色谱峰，鉴定出15种化合物，所鉴定的成分约占挥发性物质色谱峰面积的93.52%。从轻度危害的松针挥发油中可检测出约13个色谱峰，鉴定出13种化合物，所鉴定的成分约占挥发性物质色谱峰面积的100%。

2.2 松针挥发物质主要成分和相对质量分数

采用GC-MS联用技术对云南松松针提取物进行分离测定，所有处理中共分离出37种化合物，结合计算机检索技术对分离的化合物进行鉴定，共鉴定出33种挥发物成分，有4种未知物。通过对健康云南松松针和受到楚雄腮扁叶蜂不同危害程度松针挥发性物质成分的比较可知(表1)，受楚雄腮扁叶蜂危害诱导，云南松松针挥发性物质成分和含量均发生了明显变化，且危害程度不同，其挥发性物质成分和含量均存在差异。

其中，健康云南松松针中鉴定出17种挥发性物质，主要成分为石竹烯(28.76%)、毕澄茄烯(23.14%)、α-蒎烯(14.53%)、β-杜松烯(9.21%)；受楚雄腮扁叶蜂严重危害的云南松松针中共鉴定出15种挥发性物质，主要成分为毕澄茄烯(43.32%)、石竹烯(23.56%)、β-杜松烯(12.11%)；受到中度危害的云南松松针中共鉴定出19种挥发性物质，主要成分为毕澄茄烯(30.87%)、石竹烯(25.65%)、杜松烯(10.23%)；受到轻度危害的云南松松针中共鉴定出13种挥发性物质，主要成分为石竹烯(40.49%)、毕澄茄烯(17.01%)、α-蒎烯(14.38%)、β-杜松烯(8.02%)。

图1 云南松健康松针GC-MS总离子流

图2 楚雄腮扁叶蜂严重危害的云南松松针GC-MS总离子流

图3 楚雄腮扁叶蜂中度危害的云南松松针GC-MS总离子流

图4 楚雄腮扁叶蜂轻度危害的云南松松针GC-MS总离子流

健康云南松松针和受不同程度危害的松针中共有挥发性物质成分仅有3种，表明云南松松针受楚雄腮扁叶蜂危害时，受害程度不同，产生和释放的挥发性物质也存在显著差异。共有挥发性物质分别是毕澄茄烯、石竹烯和α-石竹烯，其中，毕澄茄烯和石竹烯在所有松针挥发性物质中均为主要成分，但两者在健康松针和受不同程度危害松针中的含量存在较大差异，变化范围分别为17.01%～43.32%和23.56%～40.49%。这种含量的差异也可以影响松针挥发物质的性质，对昆虫是否具有趋避或引诱作用，有待进一步研究。

3 结论与讨论

云南松松针在受到楚雄腮扁叶蜂危害后产生了大量不同于健康植株的新的挥发性物质，同时，少量化合物与健康植株挥发物组分相同，如毕澄茄烯和石竹烯等，但其含量均发生了显著变化。另一方面，受楚雄腮扁叶蜂危害的程度不同，云南松松针新产生的挥发性化合物种类及其含量也存在明显差异。

植物在遭受植食性昆虫啃食危害后，能够产生大量新的挥发性化合物组分，这些挥发物与健康植株和受机械损伤植株释放的挥发物组分或含量明显不同，因此，被称为虫害诱导植物挥发物。前人已对虫害诱导不同植物挥发物组分进行了大量研究[9-12]。不同植物种类、不同部位、不同生育期以及不同受害程度的植株受到昆虫啃食后释放的虫害诱导挥发物成分和含量均存在明显差异，同时，昆虫的种类、危害方式、程度等因素也会对挥发物成分和含量产生影响。例如，不同地区的马尾松(P.massioniana)松针挥发物含量与松毛虫(Dendrolimuspunctatus)暴发情况之间存在明显相关性，常灾区、偶灾区和无灾区受松毛虫危害的马尾松松针挥发性物质组成比例差异很大[12]。大菜粉蝶(Pierisbrassicae)等咀嚼式昆虫与麦长管蚜(Macrosiphumavenae)、麦二叉蚜(Schizaphisgraminum)等刺吸式昆虫危害植物后产生的挥发性化合物组分存在明显不同[13]。另一方面，植物遭受昆虫危害后，挥发性物质组分含量发生了明显变化。例如，马尾松松针在受到松毛虫危害后，挥发性物质的相对含量除水芹烯降低外，其余均在1 h内出现明显升高[14]。湿地松松叶受到虫害后，挥发性物质氨茴酸-3，5-二甲基-3-乙烯基-4-己烯酯和大香叶烯D的含量均发生了显著变化[14]。而甘蓝(Brassicaoleracea)在遭遇大菜粉蝶(Pierisbrassicae)啃食后，可诱发植株释放大量挥发性化合物，但释放的挥发物成分与健康植株基本相同，并没有产生新的挥发性物质，只是释放挥发物的量更大，持续时间更长[14-15]。部分植物受到虫害后也会产生大量新的挥发性物质。例如，枣树叶片在受到枣镰翅小卷蛾(Ancylissativa)啃食后，叶片的挥发性物质组分和含量均会出现明显增加，并能产生特异性挥发物乙酸-4-己烯醇酯，从而使邻近枣树识别空中传递的虫害信号，提高枣树的自身防御水平[17]。同时，蚕豆(Viciafaba)叶片受到昆虫啃食后，释放的挥发性物质与健康植株也完全不同[18]。本研究中，云南松松针在受到楚雄腮扁叶蜂危害后产生了大量不同于健康植株的新的挥发性物质，同时，少量化合物与健康植株挥发物组分相同，如毕澄茄烯和石竹烯等，但其含量均发生了显著变化。另一方面，受楚雄腮扁叶蜂危害的程度不同，新产生的挥发性化合物种类和含量也存在明显差异。有研究表明，植物在受虫害后在挥发物成分上表现出来的质和量的差异是植物与天敌长期协同进化的结果[18]。植物遭受虫害后所产生的挥发物在质和量上的差异能给同类或天敌以准确且清晰的信号。

表1 不同危害程度云南松松针挥发性物质成分比较

注：NA表示未查到登录号。

与健康植株相比，受虫害植株释放出了新的挥发物，或者释放某种挥发物的量较大。植食性昆虫对植物的这些变化较为敏感，在较远的距离就能探测到这种信息。但这种信息对植食性昆虫来说具有很大的不确定性，很难预测这种信息将吸引还是排斥植食性昆虫[19]。研究表明，虫害诱导的植物挥发物可以引诱植食性昆虫的天敌[20-22]。同时，植食性昆虫也可以利用这种挥发物寻找适宜的寄主，如虫害诱导的植物挥发物可以吸引金龟子和叶甲的幼虫[23-24]。本研究表明，云南松松针在受到楚雄腮扁叶蜂危害后，产生和释放的挥发性物质成分和含量存在显著差异，且松针受害程度不同，产生的挥发性化合物也不同。松针在受到楚雄腮扁叶蜂危害所产生和释放的挥发性化合物成分和含量的变化可能也会对植食性昆虫取食行为产生一定影响。目前，松针受危害后对楚雄腮扁叶蜂或其他昆虫具有趋避或引诱作用，仍有待进一步研究。

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