苯硼酸修饰的聚乙烯亚胺系统在T 细胞小 RNA 转染的应用

黎桂妃 贡一峰,2 金 言 金 立 季黎明

1(中国科学院深圳先进技术研究院 生物医药技术研究所 深圳 518055)

2(上海大学生命学院 上海 200444)

3(上海交通大学医学院附属同仁医院老年科 上海 200336)

4(上海市静安区市北医院内分泌科 上海 200443)

1 引 言

非编码小 RNA(Small Noncoding RNAs，sncRNA)是物种间高度保守的、不编码蛋白质的 RNA，长度在 17～250 个核苷酸[1-3]。非编码小 RNA 具有广泛的调节功能：如微小RNA(microRNA，miRNA)和小干扰 RNA(smallinterfering RNA，siRNA)等通过 RNA 诱导沉默复合体到靶位点，发挥调控功能；如染色质模型、转录后抑制和与 mRNA 3＇端配对后导致的mRNA 失稳等[4]。

T 淋巴细胞是机体重要的免疫细胞[5]。研究显示，非编码小 RNA 参与了 T 细胞从发育、活化及功能行使等多个生物过程的调节[6]。因此，对 T 细胞进行非编码小 RNA 的相关操作，对炎性疾病[7,8]、肿瘤[9]和感染[10]等疾病的基础研究和临床实践都具有重大意义。但是，至今仍缺乏针对 T 细胞，尤其是原代 T 淋巴细胞的小 RNA有效递送方法。

目前，T 细胞对 RNA 的摄取方法有间接和直接两种。其中，间接方法主要通过病毒载体，如腺病毒和慢病毒[11]转入相应质粒，进而在感染细胞内进行 RNA 表达。但病毒介导的导入受限于目标细胞的扩增，并且在突变、炎症和免疫应答等方面存在潜在风险。直接方法有电穿孔和核转染(Nucleofector)，可直接对 T 细胞进行 RNA导入。该类方法通过高电压下 T 细胞细胞膜瞬时通透，小 RNA 可由此进入，改变电转参数可有效提高 RNA 转染的效率。但是，电击后细胞存活率过低[12]是这类方法的主要缺陷。此外，还有合成载体，如阳离子聚合物[13]、多肽[14]、脂质体[15]等直接递送技术，其可与 RNA 结合成带正电荷的载体复合物，增加与带负电荷的细胞膜之间的相互作用，进而提高细胞的内吞作用。以上间接与直接方法转染效率均不高，并且材料载体对细胞具有较大毒性。Liu 等[16]尝试构建了纳米递载系统，对人类 T 细胞系及外周血 T 细胞进行siRNA 传递。初步研究发现，单层壁碳纳米管可有效将 siRNA 递送至人源 T 细胞内，但材料对细胞的毒性和效率都尚未阐述[17]。

T 细胞细胞膜表面存在唾液酸化修饰。通过唾液酸转移酶来进行唾液酸修饰，加上敲除小鼠模型的表型表明，唾液酸修饰参与 T 细胞成熟、分化、迁移和死亡过程的调控[18]。本研究利用 Ji 等[19]设计的选择性靶向唾液酸的纳米载体PEI-PBA——共轭连接了苯硼酸(Phenylboronic Acid，PBA)的小分子量(1.8 k)聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)，介导 T 淋巴细胞摄取miRNA 和 siRNA，并研究 T 细胞不同亚群对小RNA 摄取之间的差异。

2 材料与方法

2.1 材料

聚乙烯-苯硼酸(PEI-PBA)由中国科学院深圳先进技术研究院马轶凡实验室合成；miRNA-FAM (miR01204)和 siRNA-FAM(siR05815)购自广州市锐博生物科技有限公司；人源外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)培养细胞所用培养基为 AIM-V Medium CTS(购自Gibco by life，货号为 1860610)；刺激细胞所用磁珠为 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(购自 Gibco by Thermo Fisher Scientific，货号为00347615)；细胞增殖示踪羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(5(6)-Carboxyfluorescein Diacetate N-Succinimidyl Ester，CFSE)荧光探针(C1031)购自碧云天生物科技有限公司；CCK-8 试剂盒(Cell Counting Kit，CK04)购自 DOJINDO；流式分析抗体 anti-human CD3、anti-human CD8、anti-human CD4、anti-human TCRγ/δ、anti-human TCR Vδ2 及鼠源的 anti-mouse CD3、anti-mouse CD8a、anti-mouse CD4、anti-mouse TCRγ/δ、antimouse NK-1.1 购自 Biolegend 公司。人外周血从 8位健康志愿者(21～25 岁，男性 6 位，女性 2 位)手臂抽取静脉血获得，所有操作均符合中国科学院深圳先进技术研究院人体伦理管理协议 SIATIRB-170305-H0415；C57BL/6 小鼠由广东省实验动物中心购得，所有操作均符合中国科学院深圳先进技术研究院动物伦理管理协议 SIAT-IRB-170306-YYS-JINY-A0321。

2.2 实验方法

2.2.1 人外周血 T 细胞培养

将采集的人外周血单核细胞(PBMC)用淋巴细胞分离液分离后，重悬于含 200 U/mL IL-2(白细胞介素 2)的(细胞治疗级)无血清细胞(AIM-V)培养基，置于 37℃、5% CO2培养箱培养。用磁珠(Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28)刺激培养至第 6 天、第 8 天分别进行相应试验。

2.2.2 小鼠 T 细胞的培养

取 6～8 周 C57BL/6 小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞，用含 10% FBS(胎牛血清)的 RPMI-1640 培养基(含 200 U/mL IL-2)重悬，置于 37℃、5%CO2培养箱培养。

2.2.3 CCK-8 测定

将用磁珠刺激培养至第 8 天的人源 T 细胞，铺板于 96 孔板(每孔 2×104个细胞)，实验组加入 PEI-PBA(终浓度 8 ng/mL)培养 24 h 后，按照 CCK-8 试剂(DOJINDO，CK04)说明书操作于 450 nm 处紫外分光光度计(BioTek)检测吸光度值。

2.2.4 荧光染料 CFSE 测定

将磁珠刺激培养至第 6 天的人源 T 细胞：首先，用终浓度为 5 μmol/L 的荧光染料——羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)工作液避光染色 3 min；其次，用 1×PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤两遍，重悬于 AIM-V 培养系统，以每孔 5×104个细胞铺板于 24 孔板中，并加入材料PEI-PBA(终浓度 8 ng/mL)进行培养；最后，培养 3 天后收集细胞，同时加入相应抗体染色，待用 4% 多聚甲醛固定后，使用 FACS CANTO II(BD)进行流式分析。

2.2.5 PEI-PBA 材料介导的转染系统在 T 细胞中对小 RNA 的转染

首先，将相应的 miRNA-FAM 或 siRNAFAM(终浓度 100 nmol/L)与 PEI-PBA 材料(终浓度 8 ng/mL)进行混匀，在室温孵育 10 min；其次，将前述混合材料体系移入对应的 T 细胞(人源和鼠源)培养系统进行培养，24 h 后收集细胞，用相应抗体染色后，采用 FACS CANTO II(BD)流式分析。

3 结果与分析

3.1 PEI-PBA 对 T 淋巴细胞的细胞毒性试验

理想的载体本身不应对 T 淋巴细胞的生物表型及生物过程具有干扰。Ji 等[19]的研究已表明，PEI-PBA 材料本身对肿瘤细胞不具备细胞毒性。为了解 PEI-PBA 对正常的淋巴细胞，尤其是对T 淋巴细胞是否存在影响，本文以人类外周血单核细胞为研究对象，首先将用 anti-CD3/CD28 磁珠刺激第 6 天进入指数级扩增的人外周血 T 淋巴细胞，采用活细胞荧光标记染料 CFSE 工作液脉冲标记后进行培养(3 天)；其次，对 2 种处理的细胞：纳米载体 PEI-PBA 处理和未处理(NC)细胞的增殖能力进行了测定，并用流式分析显示CD3+T 细胞的 CSFE 染色状态。CFSE 实验的结果如图1(a)所示：与空白对照组相比，PEI-PBA处理并不影响 T 细胞的增殖。

我们进而通过 CCK-8 实验测定了纳米载体PEI-PBA 对细胞的毒性情况，CCK-8 效应如图1(b)所示。实验对 anti-CD3/CD28 磁珠刺激第 8天的人外周血 T 淋巴细胞进行测定。其中，NC为不加 PEI-PBA 材料的空白对照组，PEI-PBA 为终浓度 8 ng/mL 的 PEI-PBA 材料处理的样品。结果显示，当空白对照组相对数值为 100% 时，PEI-PBA 平均值为 72.40%，二者无显著性差异(P＞0.05)。综上所述，PEI-PBA 材料对 T 淋巴细胞不具有明显的细胞毒性作用。

3.2 非扩增原代人外周血 T 淋巴细胞中 PEI-PBA介导的 miRNA 递送效率

miRNA 是重要的调节分子，参与 T 细胞多种与细胞扩增无关或偶联的生物过程调控。对参与扩增偶联的 T 细胞而言，现有方法如慢病毒感染可实现对扩增 T 细胞进行基因操作的目的，从而替代 miRNA 的直接转导。对非扩增状态下的 T 淋巴细胞而言，miRNA 递送效率则更为低下。因此，本文以原代外周血 T 细胞为非扩增模型，以 anti-CD3/CD28 刺激 PBMC 扩增的 T 细胞为扩增模型，分别考察了 PEI-PBA 介导的小 RNA 的摄取效率。

在人外周血原代外周血非扩增模型中，与空白对照组相比，PEI-PBA 介导的 T 细胞 miRNA转染效率明显升高，具体结果如图2(a)、2(b)所示。结果显示，CD3+T 细胞的效率总体提高至 5.99%。其中，细胞亚群 CD4+T 细胞提高5.31%；CD8+T 细胞提高 6.66%；γδT 细胞的效率达到 11.10%，为原代 T 细胞中 miRNA 递送效率最高的一种 T 细胞。

3.3 非扩增原代人外周血 T 淋巴细胞中 PEI-PBA介导的 siRNA 递送效率

siRNA 是重要的分子生物学研究方法和治疗手段。本文检测了 PEI-PBA 介导 siRNA 对原代 T细胞的递送效率，结果如图2(c)、2(d)所示。在未扩增的人外周血 T 细胞中，PEI-PBA 对 CD3+T细胞的 siRNA 递送效率达到 6.34%。其中，细胞亚群 CD4+T 细胞 4.85%，CD8+T 细胞 6.22%，γδT 细胞 14.45%。

总体而言，在未扩增的原代 T 细胞体系中，PEI-PBA 介导的 siRNA 递送效率与 miRNA的相当，可以实现对原代 T 细胞进行小 RNA 水平操纵。

图1 PEI-PBA 对 T 细胞安全性评估Fig. 1 Cytotoxicity of PEI-PBA in T cell

图2 PEI-PBA 材料介导的转染系统的人外周血 T 细胞未扩增时各亚群对小 RNA 的摄取率Fig. 2 Uptake of small RNAs in T cell subsets of human PBMC by PEI-PBA

3.4 扩增状态下人源 T 淋巴细胞中的 PEI-PBA介导的 miRNA 递送效率

随后我们对经过 anti-CD3/CD28 磁珠刺激(8 天)并进入指数级扩增的人外周血 T 淋巴细胞进行了 PEI-PBA 包裹的 miRNA 递送效率检测，结果如图3(a)、3(b)所示。结果显示，T细胞(CD3+T 细胞)整体摄入 miRNA 比例达到18.43%。其中，细胞亚群 CD4+T 细胞 14.59%，CD8+T 细胞 18.99%，γδT 细胞 25.98%。可见，PEI-PBA 对 CD3/CD28 活化扩增至第 8 天的人外周 T 细胞显示出有效的 miRNA 递送能力，显著高于非扩增状态的 T 细胞各亚群细胞。

3.5 扩增状态下人源 T 淋巴细胞中的 PEI-PBA介导的siRNA 递送效率

与 PEI-PBA 介导 miRNA 递送效率不同的是，在 anti-CD3/CD28 磁珠刺激的人外周血 T淋巴细胞中，与非扩增性原代 T 细胞组相比，PEI-PBA 介导的 siRNA 递送效率并没有发生显著改变，结果如图3(c)、3(d)所示。CD3+T 细胞的 siRNA 转染效率为 5.52%。其中，细胞亚群 CD4+T 细胞 4.12%，CD8+T 细胞 5.82%，γδT细胞13.67%。T 细胞是否活化和扩增，对各个亚群的 siRNA 转染效率无关。

3.6 PEI-PBA 介导的原代鼠源 T 淋巴细胞小 RNA递送效率

为检测 PEI-PBA 系统是否适用于鼠源 T 细胞，本文对 C57BL/6 小鼠脾脏和胸腺 T 淋巴细胞进行了 PEI-PBA 包裹小 RNA 的转染：将终浓度为 100 nmol/L 的 miRNA 或 siRNA，与终浓度为8 ng/mL 的材料 PEI-PBA 共孵育后移入 C57BL/6小鼠脾脏和胸腺T细胞中培养24h并进行流式分析。图4 与附录(图Ⅰ、Ⅱ)结果显示，与空白对照组相比，PEI-PBA 纳米载体仅对小鼠脾脏 CD8+T细胞具有递送效率，对 miRNA 和 siRNA 的摄取效率分别提高至 1.72 % 和 1.85%，并具有显著差异。

图3 PEI-PBA 材料介导的转染系统的人外周血 T 细胞扩增后各亚群对小 RNA 的摄取率Fig. 3 Uptake of small RNAs in T cell subsets of stimulated human PBMC by PEI-PBA

图4 PEI-PBA 介导的原代鼠源脾脏 CD8+ T 淋巴细胞小RNA 递送效率Fig. 4 Uptake of small RNAs in CD8+ T cell subsets of spleen from C57BL/6 mice by PEI-PBA

4 讨论与小结

作为近来工程细胞治疗的热点细胞，T 细胞的转染尤其是小 RNA 的转染始终是领域中的技术难点。前期 Liu 等[16]和 Freeley 等[17]报道对人源 T 细胞进行 siRNA 传递的纳米管递载系统，因缺乏对细胞毒性和效率的评估而无法进行实际应用。目前 siRNA 最广泛应用的 Nucleofector 系统，虽然核转染效率较高，但转染 24 h 内细胞死亡率过高，仅 17% 的 T 细胞可以存活[20]。由于Nucleofector 的操作步骤复杂且昂贵，由死亡率反推要求大量的起始细胞数量，极大地限制了 T细胞中 siRNA 及小 RNA 的应用和研究。

与肿瘤细胞一样，T 细胞具有细胞膜表面唾液酸化修饰的细胞特征。选择性靶向唾液酸的纳米材料 PEI-PBA 在高唾液酸修饰的肿瘤细胞系统中已证明了安全性和有效性。基于 T 细胞与肿瘤细胞不同的代谢及修饰途径，本文在 T 细胞系统中再次检测了 PEI-PBA 的生物安全性。经 PEIPBA 处理的 T 细胞存活率达 72% 以上，并且对后续的 T 细胞增殖无影响，体现了较好的生物应用价值。并且 PEI-PBA 介导的小 RNA 转染方法对起始细胞数没有要求，可对低细胞数 T 细胞进行转染操作，操作方法步骤简单、快速，结合其较高的转染效率，如对人外周血 CD3+T 细胞18.43% 的小 RNA 转染效率，可有效地满足研究和应用的需求。

本文工作系统地比对了人、鼠两种来源 T 细胞的不同亚群，以及不同类型小 RNA(miRNA和 siRNA)摄取之间的差异。结果显示，纳米载体 PEI-PBA 可以简单、安全、有效地介导人源 T淋巴细胞小 RNA 转染，但对鼠源 T 淋巴细胞基本无效。就人源 T 淋巴细胞转染而言，PEI-PBA可有效介导 miRNA 的转染，且效率在活化扩增后有显著提高；而 PEI-PBA 介导的 siRNA 转染效率则不受 T 细胞状态影响。在不同的 T 细胞群体，如 CD4+T 细胞、CD8+T 细胞和γδT 细胞中，PEI-PBA 介导的转染效率不同，其中对γδT细胞的转染效率最高。这可能与不同细胞亚群细胞膜表面的唾液酸水平相关。另外，由于个体差异，转染效率在不同志愿者中差异较大，导致结果的统计方差也较大。

[1]Azhikina TL, Ignatov DV, Salina EG, et al. Role of small noncoding RNAs in bacterial metabolism[J]. Biochemistry Biokhimiia, 2015, 80(13): 1633-1646.

[2]He YD, Ju CY, Zhang XB. Roles of small RNAs in the immune defense mechanisms of crustaceans [J].Molecular Immunology, 2015, 68(2, Part B): 399-403.

[3]Eddy SR. Non-coding RNA genes and the modern RNA world [J]. Nature Reviews Genetics, 2001,2(12): 919-929.

[4]Affymetrix/Cold Spring Harbor Laboratory ENCODE Transcriptome Project. Posttranscriptional processing generates a diversity of 5′-modi fi ed long and short RNAs [J]. Nature, 2009,457(7232): 1028-1032.

[5]Groux H, Powrie F. Regulatory T cells and inflammatory bowel disease [J]. Immunology Today, 1999, 20(10): 442-445.

[6]Ruggero K, Guffanti A, Corradin A, et al. Small noncoding RNAs in cells transformed by human T-cell leukemia virus type 1: a role for a tRNA fragment as a primer for reverse transcriptase [J].Journal of Virology, 2014, 88(7): 3612-3622.

[7]Steward-Tharp SM, Song YJ, Siegel RM, et al.New insights into T cell biology and T cell-directed therapy for autoimmunity, inflammation, and immunosuppression [J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 2010, 1183(1): 123-148.

[8]Getts DR, Shankar S, Chastain EML, et al. Current landscape for T-cell targeting in autoimmunity and transplantation [J]. Immunotherapy, 2011, 3(7):853-870.

[9]Hinterleitner R, Gruber T, Pfeifhofer-Obermair C, et al. Adoptive transfer of siRNAcblb-silenced CD8+T lymphocytes augments tumor vaccine ef fi cacy in a B16 melanoma model [J]. PloS One, 2012, 7(9):e44295.

[10]Boutimah F, Eekels JJM, Liu YP, et al. Antiviral strategies combining antiretroviral drugs with RNAi-mediated attack on HIV-1 and cellular cofactors [J]. Antiviral Research, 2013, 98(1): 121-129.

[11]Usme-Ciro JA, Campillo-Pedroza N, Almazán F, et al. Cytoplasmic RNA viruses as potential vehicles for the delivery of therapeutic small RNAs [J].Virology Journal, 2013, 10(1): 1-10.

[12]Gehl J. Electroporation: theory and methods,perspectives for drug delivery, gene therapy and research [J]. Acta Physiologica Scandinavica, 2003,177(4): 437-447.

[13]Kesharwani P, Gajbhiye V, Jain NK. A review of nanocarriers for the delivery of small interfering RNA [J]. Biomaterials, 2012,33(29): 7138-7150.

[14]Shukla RS, Qin B, Cheng K. Peptides used in the delivery of small noncoding RNA [J]. Molecular Pharmaceutics, 2014,11(10): 3395-3408.

[15]Asai T, Oku N. Systemic delivery of small RNA using lipid nanoparticles [J]. Biological &Pharmaceutical Bulletin, 2014, 37(2): 201-205.

[16]Liu Z, Winters M, Holodniy M, et al. siRNA delivery into human T cells and primary cells with carbon-nanotube transporters [J]. Angewandte Chemie (International ed. in English), 2007, 46(12):2023-2027.

[17]Freeley M, Long A. Advances in siRNA delivery to T-cells: potential clinical applications for in fl ammatory disease, cancer and infection [J]. The Biochemical Journal, 2013, 455(2): 133-147.

[18]Eylar EH, Madoff MA, Brody OV, et al. The contribution of sialic acid to the surface charge of the erythrocyte [J]. Journal of Biological Chemistry,1962, 237(6): 1992-2000.

[19]Ji M, Li P, Sheng N, et al. Sialic acid-targeted nanovectors with phenylboronic acid-grafted polyethylenimine robustly enhance siRNA-based cancer therapy [J]. ACS Applied Materials &Interfaces, 2016, 8(15): 9565-9576.

[20]Wayteck L, Xiong RH, Braeckmans K, et al.Comparing photoporation and nucleofection for delivery of small interfering RNA to cytotoxic T cells [J]. Journal of Controlled Release, 2017, 267:154-162.