代谢组学技术在乳腺癌标志物筛选中的应用进展

吴静，杨睿，刘树业△

代谢组学（metabonomics）是“后基因组学”时期的一门新兴学科，同基因组学、转录组学、蛋白质组学共同构成了系统生物学的核心内容［1］。与基因组学、转录组学以及蛋白质组学相比，代谢组学更关注生物体的表型，因此也是肿瘤潜在生物标志物筛选中最有前景的发展方向［2］。代谢组学以体液（包括尿液［3］、血清［4］、血浆等）、细胞［5］、组织［6］等样本中分子质量低于1 ku的小分子化合物为研究对象，运用液相色谱-质谱联合技术（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）、气相色谱-质谱联合技术（gas chromatograph mass spectrometer，GC-MS）、磁共振波谱技术（nuclear magnetic resonance，NMR）等［7］高分辨率、高敏感度、高通量的现代仪器分析手段，对生物体系在生理或病理状态下所有内源性小分子代谢产物的动态变化进行分析，从而描绘出生物体代谢轮廓，揭示代谢通路的改变［8］，探索内源性小分子物质与疾病发生发展间的关系［9］。

代谢组学的研究过程包括生物样本的采集及预处理，代谢物的分离、检测、鉴定以及数据分析，生物标志物识别和途径分析。相比较于基因、转录和蛋白质组学，代谢组学技术具有明显的研究优势：生物体内的小分子化合物的组成较基因组、蛋白质组相对简单，数量大约数千种；很多内源性小分子化合物的生化代谢网络已经弄清，而目前对基因、蛋白质功能的认识还很有限；代谢组学反映的是细胞活动的最终产物［10］，也是基因组、转录组和蛋白质组综合作用下的终末效应，具有很强的综合信息优势。因此，代谢组学被广泛应用于多个领域，包括疾病诊断［11］、新药研究与开发、药物作用机制研究［12］和食品科学［13］等。

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着女性的健康［14-15］。目前研究已证实，乳腺癌的发生和进展与代谢异常密切相关［16］，而乳腺癌的常规检测与研究中又缺乏高敏感度和高特异度的肿瘤标志物［17-18］，因此作为一种新型的研究方法，代谢组学可以分析乳腺癌发生发展中产生的所有代谢物的种类或浓度的变化［19］，识别有价值的潜在标志物，从而为乳腺癌的预防、早期诊断和个体化治疗开辟新途径。近年来，国内外学者通过代谢组学技术对乳腺癌患者的血清、血浆、尿液、组织等样本中的小分子代谢物进行了研究，并取得一定的成效［20-21］。本文针对代谢组学技术筛选出的乳腺癌小分子代谢标志物的研究现状进行综述。

1 乳腺癌血液样本潜在代谢标志物的筛选

血液样本是代谢组学研究中最易获得且最常用的样本。Cui等［22］利用基于质谱的代谢组学技术研究了20例乳腺浸润性导管癌患者和20例健康人的血清代谢谱，发现15个差异表达代谢物，这些代谢物参与了包括神经鞘脂类代谢、磷脂代谢和脂肪酸β氧化等多个代谢途径，其中溶血磷脂酰乙醇胺和神经酰胺两类信号脂类分子可能在乳腺浸润性导管癌的发生发展中发挥了重要作用。因此，研究者认为代谢组学分析可能成为寻找疾病生物标志物的有利工具。Fan等［23］通过液相色谱-质谱和气相色谱-质谱的方法对96例乳腺癌患者和79例健康人的血浆进行分析后发现了64个差异表达代谢物，与人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）阴性乳腺癌患者相比，HER-2阳性患者有氧糖酵解增加、葡萄糖异生和脂肪酸生物合成增多以及三羧酸循环减少；与雌激素受体（estrogen receptor，ER）阴性患者相比，ER阳性患者丙氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸和嘌呤代谢增加，甘油脂类分解代谢减少；研究者鉴定了8个差异性代谢物，包括肉碱、溶血磷脂胆碱［lysoPC（20：4）］、脯氨酸、丙氨酸、溶血磷脂胆碱［lysoPC（16：1）］、鹅脱氧胆碱甘氨酸、缬氨酸和2-辛烯二酸，它们可以用于预测乳腺癌的分子亚型，其受试者工作特征（ROC）曲线下面积（area under the curve，AUC）高达0.925，因此这些代谢物具有潜在的乳腺癌诊断价值。Leonardo等［24］利用高分辨率磁共振光谱技术分析了80例ER阴性早期乳腺癌和95例转移性乳腺癌患者的血清样本代谢谱，结果发现葡萄糖、脂类含量在转移性乳腺癌组升高，组氨酸含量在转移性乳腺癌组降低，这些代谢产物可以很好地区分早期乳腺癌和转移性乳腺癌患者且与乳腺癌复发相关；研究者进一步应用风险预测模型对乳腺癌的复发进行了预测，其敏感度、特异度和预测准确性分别为82%、72%、75%，由此认为将血清代谢组学预测模型应用于ER阴性早期乳腺癌的复发预测具有广阔的前景。Miolo等［25］运用液相色谱串联质谱结合（Liquid chromatographycoupledwithtandemmass spectrometry）对HER-2阳性乳腺癌患者应用曲妥单抗联合紫杉醇治疗后的有效组（15例）和疗效不佳组（19例）血清进行研究后发现，2个代谢物亚精胺和色氨酸可很好地区分2组患者，敏感度和特异度分别高达90%和87%。因此这一结果对于预测乳腺癌患者治疗的疗效和进行个体化治疗具有重要价值。

2 乳腺癌组织样本潜在代谢标志物的筛选

在组织代谢物的研究方面，Budczies等［21］利用气相色谱和飞行时间质谱技术对270例乳腺癌组织和97例正常乳腺组织样本进行代谢组学分析后发现，在正常乳腺组织中谷氨酸与谷氨酰胺含量呈正相关，而两者在乳腺癌组织中呈负相关，56%的ER阳性乳腺癌组织和88%的ER阴性乳腺癌组织中谷氨酸的表达水平显著升高；研究者通过单因素和多因素分析发现谷氨酸/谷氨酰胺水平升高与总体生存期延长有关，基因表达分析显示谷氨酸水平升高与过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）途径的激活呈负相关，因此认为谷氨酸可能成为诊断乳腺癌的潜在生物标志物，为乳腺癌患者应用谷氨酰胺酶抑制剂治疗提供了有利依据。Haukaas等［10］运用高分辨率魔角自旋磁共振光谱（High-resolution magic-angle spinning magnetic resonance spectroscopy，HR MAS MRS）结合层次聚类分析对228例未治疗过的乳腺癌患者组织样本进行研究，发现了3个有明显差异代谢谱的代谢簇——Mc1、Mc2、Mc3，其中Mc1中甘油磷酸胆碱（GPC）和磷酸胆碱（PCho）的含量最高，Mc2中葡萄糖含量最高，而Mc3中乳酸盐和丙氨酸含量最高；研究者进一步通过代谢物综合通路分析结合基因、蛋白质表达数据揭示了3个代谢簇在糖酵解/糖异生和甘油磷脂代谢方面具有显著差异，乳腺癌相关蛋白亚型的表达分布也具有明显差异，如胶原蛋白和细胞外基质相关的基因在Mc1中表达下调，而在Mc2和Mc3中表达上调。这一结果不仅为乳腺癌的异质性提供了新的信息，更重要的是为乳腺癌患者应用不同代谢靶向药物进行治疗提供了重要指导。

3 乳腺癌尿液样本潜在代谢标志物的筛选

在尿液代谢物的研究方面，Yu等［26］应用毛细管电泳联合质谱方法分析了21例晚期乳腺癌患者化疗前后和21例健康人的尿液样本后发现，与健康人相比，对化疗敏感的患者30%的代谢物发生水平改变，而对化疗不敏感的患者只有9%的代谢物发生水平改变；在化疗敏感组患者中，甘氨酸、半胱氨酸、组氨酸、胱氨酸和色氨酸的水平在化疗后显著下降，而在对化疗不敏感的患者中，大部分氨基酸均未表现出明显的差异。因此，研究者认为尿液代谢产物有望作为评估乳腺癌患者化疗疗效的潜在预测指标。Fathi等［27］通过液相色谱串联质谱方法对全世界首例报道的异柠檬酸脱氢酶1（isocitrate dehydrogenase1，IDH1）p.R132L突变的转移性激素受体阳性（hormone receptor-positive，HR+）乳腺癌患者和6例无IDH1突变的转移性HR+乳腺癌患者的血清和尿液样本进行分析后发现，具有IDH1 p.R132L突变患者的血清和尿液中2-羟基戊二酸（2-hydroxyglutarate，2-HG）水平显著升高，因此他们认为IDH1突变诱发的乳腺癌可能与癌代谢物2-HG的异常产生和蓄积有关。这一结果为通过无创检测2-HG的水平来监测乳腺癌，以及开发和研究针对异常IDH1酶的靶向治疗提供了重要指导。

目前，代谢组学研究已经成为肿瘤研究的一个新方向。代谢组学整体性、宏观性、高通量、廉价快捷的特点使其在乳腺癌潜在标志物的筛选方面具有无可比拟的优势，许多小分子已经在临床诊断中应用。尽管如此，代谢组学要想在临床肿瘤检测中被广泛推广和应用，还需要进一步完善和发展，如建立样本获取、保存和制备的统一标准流程，不断扩大和更新将不同肿瘤特征表型与相关代谢组学数据相联的公用数据库，进一步降低检测成本。此外，还需要经过更大规模的前瞻性的临床研究来验证筛选出的代谢标志物在肿瘤的诊断、治疗、疗效评估方面的敏感度和特异度，才能最终将其作为肿瘤标志物应用于临床。此外，随着“精准医疗”概念在临床诊断和治疗中的推广，未来将个体的代谢组学数据结合基因组学、蛋白质组学分析可以更好地指导临床肿瘤的个体化治疗。