细胞外基质在周围神经修复组织工程学中应用的研究进展

蒋锐 於子卫

1 昆山市中医医院耳鼻喉科(昆山 215300)； 2 上海市第一人民医院耳鼻咽喉头颈外科

周围神经损伤可以导致毁灭性的功能残疾，影响生活质量, 在美国每年造成成千上万人严重的社会和经济负担[1]。周围神经损伤多数由外伤或者手术引起，修复和重建周围神经缺损一直是世界性的难题，一般来说,大部分周围神经损伤超过3厘米就将导致神经功能恢复不良。以往神经自体移植术被认为是外周神经修复的"金标准",但是应用显微外科技术修复的神经无论是采用外膜还是束膜缝合, 总会有部分神经束错位而失去功能[2]。通过自体神经移植修复周围神经获得临床功能恢复的患者大概只有80%左右[3]，而且存在供区神经功能损害, 可供神经长度和直径有限是其不可克服的缺陷，因此，寻找自体神经的替代品来桥接神经缺损,成为研究热点。研究证实, 雪旺细胞和束膜结构在神经再生中起重要作用,但也是免疫原性的主要携带者，而为了去除其免疫原性，同种异体神经移植物经过放射线照射、低压冻干、热或冷的器官保存液等预处理使其中的雪旺细胞凋亡,导致引导神经再生的能力大大下降[4, 5]。如何桥接神经断端并引导神经生长锥向前生长成了外周神经损伤修复的难点，因此组织工程方法修复神经缺损逐渐成为焦点，而其中的重点问题包括：导管材料的选择以及神经生长的微环境。

周围神经之所以不同于中枢神经，受损后可以表现为再生性，主要是由于它具有再生的微环境, 即：雪旺细胞和细胞外基质所含的基质膜。周围神经损伤后，如果不能重建适当的细胞外基质微环境来引导神经突特定地生长神经束，会导致轴突生长和神经元生存不足，从而导致疤痕形成和不良的临床结果[6,7]。周围神经损伤能否成功修复，主要取决于是否有适合其生长的微环境[8]。组织工程的基本原理和方法是将体外培养扩增的正常组织细胞吸附于一种生物相容性良好并且可以被机体吸收的生物材料上形成复合物，将细胞生物材料复合物植入机体组织，支架保护和指引轴突生长，支架中添加的成分为神经重建构建一个良好的微环境[9]。

细胞外基质(extracellular matrix,ECM)是组织中除细胞以外的所有成分，以往认为仅具有连接和支持细胞的作用，现在指自然发生沉积在细胞周围的大分子物质，其为细胞提供结构支撑和黏附位点，并在细胞黏附、迁移、增殖、分化和基因表达中起重要的信号传递作用[10]。在周围神经系统中，ECM主要存在于在神经内膜和基底层，排列在轴索雪旺细胞(schwann cell,SC)单元周围，主要由层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白I和IV组成[8, 11]。受到创伤后，ECM由入侵的成纤维细胞和分化的雪旺细胞分泌，从而形成胶原纤维和桥接神经断端的基膜管;随后,新生的轴突沿着新的ECM支架生长[12]。在外周神经系统，ECM分子沉积在细胞周围组成了雪旺细胞、神经细胞生长的微环境，以维持组织的结构完整性，为细胞的黏附、迁移提供合适的微环境[13];有报道指出，天然去细胞的ECM由于它自身天然的聚集性可以模拟组织特应的微环境[14]。纯化的ECM蛋白质,比如胶原蛋白和纤维蛋白等，由于他们能够支持轴突分枝直到神经完全修复，已经被广泛报道用于外周神经修复[15, 16]。 现有实验证明雪旺细胞来源的ECM扮演着外周神经组织导体的角色，能够增强黏附作用、细胞生长和SC的分化，并且调节轴突生长[17],因此将有可能利用ECM蛋白来促进和指导体内的神经再生过程。

本综述主要围绕周围神经来源ECM的几个主要成分，阐述其在构建组织工程神经中的作用。

1 胶原

胶原是由三条完全一样的三螺旋α链组成的三聚物的超家族，这条三螺旋α链决定了组织的结构[6,18],它是ECM中最主要的结构蛋白，并且是ECM中存在最丰富的蛋白[19]。来源于周围神经的ECM主要由Ⅰ型胶原(约90%)组成，因此,Ⅰ型胶原常用于组织工程神经的构建[20, 21]。实验证明胶原导管和硅胶管用于桥接10 mm 神经缺损，8 周后胶原导管比硅胶管更能促进轴突再生、髓鞘形成及血管生成[22]。Yu 等[23]利用电纺丝技术制造出一种胶原/PCL 支架并探索其在引导神经再生方面的作用；体外实验证明胶原/PCL制成的膜可促进SC黏附和增殖；体内实验证明胶原/PCL 支架能成功地桥接SD大鼠8 mm 神经缺损。

2 层粘连蛋白

层粘连蛋白是周围神经细胞外基质的重要成分之一，主要由雪旺细胞产生并广泛分布于细胞表面，它是基底膜中由糖蛋白类、Ⅳ型胶原和蛋白聚糖类形成的紧密网络结构中普遍存在的成分，主要存在于周围神经的内膜和束膜[24]。层粘连蛋白可能是神经系统中最重要的一类ECM蛋白质, 在周围神经系统中扮演重要的角色，具有多样化的功能，包括神经元迁移、轴突外生、髓鞘形成、神经肌肉接头的形成[25]。层粘连蛋白的存在刺激不同雪旺细胞转录因子的磷酸化，促进神经元细胞生长出更长的神经突[26]；在缺乏雪旺氏细胞层粘连蛋白G1的小鼠表现为雪旺细胞增殖、分化减少，生存和径向分类障碍，神经传导速度降低和神经髓鞘形成不良[27,12]。层粘连蛋白在周围神经再生过程中起重要作用，因此在神经损伤的修复中，常与其他材料(胶原、壳聚糖等)结合来促进神经修复[28, 29]。Deister等[30]研究发现，背根神经节的移植物在层粘连蛋白的凝胶上比在纤连蛋白、Ⅰ型胶原或透明质酸凝胶培养基上生长更好。Seo等[31]用层粘连蛋白-2来源的肽包装PPD(聚对二氧环己酮)/PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)导管来引导一段10 mm缺损的大鼠坐骨神经再生，发现层粘连蛋白-2可以促进神经早期的再生速率，显著增强再生有髓神经纤维的密度以及减少外来的多核巨细胞的渗入，从而促进神经再生。

3 纤连蛋白

纤连蛋白首先由Akers等[32]从视网膜神经节细胞中发现，它是一种细胞表面相关的糖蛋白，含有不同的功能域，可与不同的分子(纤维蛋白、胶原、肝素)相结合，其中有两个功能域与细胞黏附和神经再生有关[33]。纤连蛋白在基本上所有组织的细胞发育过程中高度表达,通过和整联蛋白、胶原、其他细胞受体以及许多其他ECM组分的相互作用在组织受损后的重建中提供支架方面起重要作用[34]。在培养皿中，相较于层粘连蛋白，纤连蛋白对于成人背根神经节细胞的促生长作用很微弱，但在外周神经损伤之后，纤连蛋白的基因在拼接上会产生几个不同的亚型，其中一些具有极强的促进生长的潜力[35,36];它可促进多种神经元轴突的生长，包括胚胎背根神经元/交感神经元和脊髓前角神经元，而它更重要的功能是为轴突再生提供纤维基质支持，促进细胞黏附和迁移[11]。纤连蛋白的糖基化影响它促进神经元生长的能力[37],在组织工程神经构建中，纤连蛋白经常单独或与其他成分一起添加来增强神经修复效果，例如，Ding等[38]用嵌入了纳米银的胶原支架，内面涂有层粘连蛋白和纤连蛋白，来桥接大鼠10 mm的坐骨神经缺损，证明其有助于轴突再生，并且神经功能恢复效果比单纯的自体神经移植好。Mukhatyar等[39]研究发现纤连蛋白可以促进SC的迁移和轴突在静电纺丝纤维基膜上的生长。最近有报道指出，培养的成人中枢神经系统细胞(来源于皮质和海马)在纤连蛋白中比在层粘连蛋白-111或112中生长好[40]；故而说明纤连蛋白在神经修复的过程中调节雪旺细胞和轴突反应方面是一种重要的ECM蛋白。由此可见，使用纤连蛋白或许可制作长段导管用于修复周围神经缺损。

4 腱糖蛋白C(tenascin C,TNC)

细胞外基质的一个主要组成部分是腱糖蛋白-C(TNC)，它是由成熟和不成熟的星形胶质细胞、放射状胶质细胞、脑膜纤维细胞、神经元子集和雪旺细胞表达的。TNC存在于成人的大多数健康组织中，但是在一些病理情况下，比如创伤、感染和肿瘤，就可以被显著诱导增长[41]。早就发现TNC具有多种功能，比如可以调节细胞迁移和癌细胞的新陈代谢[42,43]，并且可以在神经系统中通过整联蛋白调节轴突的生长方向[44]。在体内，当损伤产生后，TNC的表达会上调，近来有研究发现，神经损伤部位的纤维母细胞常与TNC一同出现，并且发现在周围神经损伤之初，TNC的水平呈时间依赖性上调；在体外，TNC调节SC的迁移，并且发现在SC和纤维母细胞共培养的环境里，敲除了TNC基因的纤维母细胞能降低SC的迁移能力[45]。研究还发现TNC通过包括β1整联蛋白在内的细胞表面受体来与细胞产生相互作用[46]。Zhang[45]通过实验证明了在周围神经损伤的修复过程中，纤维母细胞来源的TNC直接与SC表面的β1整联蛋白结合，激活Rac1酶，通过下游效应来促进SC的迁移。目前公认在病理状态下的低氧水平或者细胞因子分泌可以引起TNC的上调[47]；健康和受损伤外周神经的TNC差异性表达以及它对于SC迁移的复杂影响阐明了外周神经的修复可能受纤维母细胞来源的TNC的特定水平的动态影响。

5 神经营养因子

神经营养因子是指机体产生的能够促进神经细胞存活、生长、分化的一类蛋白质因子。神经营养因子不仅在成年神经系统存在，而且能够阻止成年神经元损伤后神经元的死亡以及调节包括突触可塑性和神经递质传递等许多神经系统功能，不仅可以减少神经变性，阻止疾病进程，而且还具有刺激轴突生长、促进再生的功能[48]。SC通过和ECM分子相互作用从而被激活，释放神经营养因子，包括脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、胶质细胞源性神经营养因子(glia cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)，已发现有特定的细胞外基质成分的特异性亲和力[49], 例如，神经营养因子-3(NT-3)和脑源性神经营养因子(BDNF)对纤维蛋白原有良好的亲和力。在神经再生过程中，细胞与ECM蛋白的相互作用在控制细胞的附着、迁移、增殖和分化中起重要作用[50]，这些相互作用也引导了细胞因子激活、细胞凋亡，并负责激活细胞内信号转导[51]。

早期对于神经支架的尝试是使用纯化的ECM单成分，比如胶原、纤维蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白和透明质酸等[52～54]，但都以失败而告终[55]。相较于单一成分ECM制备的支架，组织来源ECM 的支架能够更好的保持天然神经的基本结构及促进周围神经的修复[56]。Gu等[57]组装了一个以壳聚糖/丝心蛋白为基础的、SC来源的、ECM修饰的支架，来桥接大鼠坐骨神经10 mm的缺损，结果发现经过ECM改良的支架对于神经再生修复的支持比单纯支架显著有效。因此，ECM修饰的神经移植物作为分子和细胞的替代品在神经损伤的治疗方面拥有广阔的前景，未来的研究必然会向ECM改良的神经移植方向发展。

目前神经支架存在的主要问题是这些神经营养趋化因子在神经导管中降解失活较快，尤其通透性较大的生物型导管；新的给药及控释技术显示了良好的前景，能够在神经再生的长时间内持续释放这些因子。另一问题是现在大多数是以单个因子作为实验对象，各种因子的最佳组合配方尚不清楚。外周神经的细胞和分子治疗还面临着一些问题，如：细胞和生长因子的应用种类和数量、它们的分子递呈、细胞的生存及因子活性、细胞表型稳定性、治疗时机的调控以及昂贵的费用等[58]，均需要进一步研究，以期获得一种高效、经济、易获得的神经修复支架。