胰腺癌侵袭转移作用机制的研究进展

陈小艳 ，贾建新

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是当今世界上死亡率最高的肿瘤之一。近几年发病率迅速上升，因其早期症状不明显、诊断手段缺乏、肿瘤标志物特异性差、易发生早期淋巴结转移和远处转移，晚期难以手术而被称为“癌中之王”。PC手术治疗疗效不佳，对放化疗的敏感性较低。目前对于PC的发病机制、侵袭转移研究及靶向治疗的研究越来越多。本文就PC侵袭转移机制的研究进展综述如下。

1 小干扰RNA（miRNAs）在PC侵袭转移过程中的作用

miRNAs和多种恶性肿瘤的转移有关，包括胰腺导管腺癌（PDAC），一些miRNAs能调控表观遗传转移相关基因的表达，并且是一些信号通路的重要分子[1]。

1.1 主要miRNAs在PDAC中的表达及参与侵袭转移的机制 Tavano等[2]分析了 miRNA−143和miRNA−21的表达与PDAC患者临床病理特征的相关性，结果miRNA−143表达与淋巴结转移呈负相关。最近证实，胰腺肿瘤相关的成纤维细胞（tumor−associated fibroblasts，TAFs）存在miRNA−21的表达上调，可能是由于肿瘤细胞与其相互作用引起的。在TAFs中miRNA−21的表达促进了胰腺肿瘤细胞的侵袭和转移[3]。

另一项研究发现，胰腺星形细胞（PSCs）可诱导PC细胞中miRNA−210的表达，从而促进上皮间质转化（EMT）和细胞迁移。miRNA−96能直接下调KRAS癌基因来限制癌细胞的侵袭和转移[4]。研究表明，miRNA−10a和miRNA−10b在PC中表达明显升高[5]，进一步证实miRNA−10a通过抑制HOXA1、HOXB1和HOXB3基因，部分提高了癌细胞的侵袭能力；miRNA−27a在PC中过表达，具有癌基因的作用，其抑制剂通过诱导肿瘤抑制基因Spry2抑制PC细胞的生长和恶性行为。另有研究首次发现miR−29b−2−5p可能通过抑制AKT表达抑制PC细胞的迁移[6]。

1.2 miR−130b在PC侵袭转移中的作用 研究发现，miR−130b在PC组织和细胞系中经常被下调，其通过诱导凋亡和阻滞细胞周期，抑制了PC在体内外的增殖和体外的侵袭性[7−8]。miR−130b的下调与肿瘤大小、TNM分期、淋巴转移和远处转移有明显的相关性。此外，多因素分析表明，低miR−130b表达、TNM分期较晚和远处转移是PC患者总体生存率较差的重要预后因素[8−9]。进一步鉴定miR−130b 在PC侵袭性中的作用发现，用miR−130b转染复位后，panc1和aspc−1细胞的侵袭明显受到抑制。这些结果均显示miR−130b可能参与抑制PC转移的进展。因此，将miR−130b引入癌细胞的方法对PC的临床治疗有潜在的可行性，特别是对于那些有较低的miR−130b表达的肿瘤组织[7，9]。

STAT3通过促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、促进血管生成、侵袭和转移，参与癌症的发生和发展。生物信息学分析表明，STAT3可能是miR−130b的潜在靶点之一[9]。荧光素酶活性数据显示，miR−130b能够直接瞄准STAT3的3′UTR。qRT−PCR和Western blot结果显示，过表达的miR−130b通过干扰和降解mRNA，下调了PC中STAT3的表达，而抗miR−130b上调了STAT3的表达。目前的研究表明，miR−130b可以通过STAT3靶点抑制PC的生长和侵袭，miR−130b可能是PC的潜在预后生物标志物[7，10]。

1.3 非编码RNA（non−coding RNAs，ncRNAs）的作用 ncRNAs是一类不编码蛋白质的RNA分子，现在它们因能够调控多种基因而广为人知[11]。ncRNAs能在多种生理条件下发挥重要作用，包括几乎所有类型的癌症[11]。长链非编码RNA（lncRNA）H19已被证实在胰腺肿瘤组织和细胞系中明显过度表达，与肿瘤的侵袭性和迁移潜力呈正相关[12−13]。与Hox反义引物基因间RNA（HOTAIR）有关的研究已经证实，与癌旁组织相比，其在胰腺肿瘤组织中过表达[11]。通过RNA干扰（RNAi）技术抑制PC细胞系中HOTAIR的表达可降低细胞增殖，诱导细胞凋亡，同时抑制体内细胞的侵袭[11]。另一种ncRNA HoxA基因簇末端转录本（HOTTIP）在PC组织和细胞系中被观察到显著上调。抑制HOTTIP降低了其所诱导的细胞增殖、EMT、侵袭和转移能力，同时增加了吉西他滨的化学敏感性[14−15]。

EMT是肿瘤侵袭和转移的重要途径[16]。转录因子如SNAIL、SLUG、TWIST和ZEB1/2在EMT中被检测到。此外，已经发现miRNA−1271在PC组织中表达明显降低，其通过增加TWIST和ZEB1的表达，可以抑制EMT[17]。EST−1也被认为是通过ZEB2在PC中进行EMT的调节，从而增加了癌细胞的运动能力[16]。

1.4 miRNA−150调节黏蛋白（MUC4）表达下调，抑制肿瘤转移 MUC4被证实在PDAC高表达。Choudhury等[18]发现MUC4的高表达与PDAC的远处淋巴结转移及远处肿瘤生长有显著的相关性。miRNA−150调节MUC4表达下调，导致下游信号降低，然后抑制PC的生长、浸润和转移。然而，一些肿瘤抑制miRNAs能直接或间接影响癌细胞的干细胞从而抑制肿瘤的转移[19]。

2 PC中异常表达的主要蛋白

2.1 表皮生长因子（EGF）及其受体EGFR在PC侵袭和转移中的作用 95%的PC异常地表达EGFR、人表皮生长因子受体−2（HER2）和HER3及其同源配体，促进EGFR家族成员的组成性激活，从而导致PC增殖[20]。EGF和EGFR同时上调表明，在受体和配体的调控中可能存在一个闭合回路[21]。临床资料显示，上调的EGFR可能与更激进的肿瘤行为有关。EGFR活性的增加也与PC手术后更高的复发率有关[21]。

跨膜蛋白MUC4、EGFR和HER2在PC的侵袭转移中起着至关重要的作用[22]。研究发现，广谱EGFR抑制剂（canertinib和afatinib）的使用导致了MUC4的减少，并降低了MUC4在PC体内、体外的致癌功能。从而有助于抑制PC的增殖和转移。值得注意的是，在PC中，EGFR家族成员的沉默可以通过减少磷酸化−STAT1来降低MUC4表达。

2.2 基质源性细胞因子（CXCL12）对肿瘤进展、转移和耐药的影响 CXCL12能够促进肿瘤进展、转移和耐药。前转移灶的形成被认为是肿瘤细胞早期扩散的原因。研究显示基质金属蛋白酶抑制物−1有助于PC的肝转移[11，23]。癌细胞之间及癌细胞与其他细胞之间的通讯，虽然是膜结合的囊泡（外泌体），但也参与了PC的早期转移。外泌体现在被广泛认为是细胞信使，与癌症的发生有关。与非转移性患者相比，在最终发生肝转移的PDAC患者中，巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）−阳性外泌体的水平相对较高。此外，这些起源于肿瘤细胞的MIF−阳性外泌体有助于形成一个前转移灶，进而在肝脏上出现继发转移灶。研究显示纤维母细胞分泌的外泌体通过提供代谢物使得肿瘤细胞在饥饿或其他不利条件下促进肿瘤细胞的代谢重编程[24]。另一项研究表明，胰腺肿瘤细胞衍生的外泌体有某些整合素，这些整合素的模式决定了肿瘤细胞的器官转移[11]。

3 缺氧在PC侵袭和转移中的作用机制

3.1 低氧活化的Notch对PC侵袭和转移的影响机制 缺氧在PC侵袭和转移的研究中显示，与正常组织相比，PDAC的平均氧合量明显降低[25]。人类PDAC是高度低氧的，肿瘤内部的缺氧是PDAC微环境的重要组成部分。在PDAC的小鼠模型中，低氧肿瘤区域具有高度的糖酵解水平，同时释放大量乳酸，由附近的常氧肿瘤细胞代谢来维持增殖。另外，PC除了葡萄糖，还会分解谷氨酰胺，以增加缺氧条件下的存活能力。在这个小鼠模型中，一种Notch抑制剂与吉西他滨联合使用，通过破坏肿瘤血管系统显示出了模型小鼠的生存优势。PDAC的血管生成对缺氧不敏感，可能有助于进一步持续耐受低氧。即使这样，缺氧对肿瘤基质也具有深远的影响，因为其促进了纤维组织增生。此外，癌细胞远离低氧区域向血管迁移被认为触发了侵袭和转移；在人类的PC中，缺氧通过激活缺氧诱导因子1α（HIF−1α）依赖的Notch信号传导通路，增加了侵袭性伪足的形成以及它们的活性。虽然Notch信号对PC进展的贡献似乎与环境有关，但这些数据表明，低氧活化的Notch可能会增强PC的侵袭和转移[25−26]。

3.2 缺氧对PC基质的影响 缺氧诱导PC侵袭的其他机制包括尿激酶型纤溶酶原激活及其受体的表达增加，从而促进PC的侵袭并且进入血管内；以及HIF−1α协调的肌动蛋白连接蛋白fascin的诱导，增加了基质金属蛋白酶（MMP）−2在人类PC中的表达。根据其他癌症相关知识，缺氧可通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）氧化酶作用生成氧自由基，促进PC侵袭性伪足生成。此外缺氧也会影响胰腺基质的低血管性，从而进一步增强肿瘤微环境下的缺氧。很多研究也表明，缺氧诱导了PC中的Sonic Hedgehog配体的表达，其以旁分泌的方式，与成纤维细胞中的Patched−1受体结合，促进了Ⅰ型胶原和纤连蛋白的分泌，这可能会促进纤维组织增生[26]。

3.3 缺氧在PC转移级联的其他步骤中的作用 虽然缺氧诱导肿瘤淋巴管生成，但在PDAC中未检测到新淋巴管的形成，这提示PC的淋巴管转移发生在瘤周而非在肿瘤内部。淋巴管播散是PDAC一个重要的特性，缺氧信号可能是促进淋巴结转移重要因素，因为在这些病变中可以检测到HIF−1α水平的升高。向小鼠的胰腺内植入表达HIF−1α的人类PC细胞，肿瘤从胰腺蔓延至腹腔后、腹膜、肝脏，HIF−1α的活性也提高了；从这些小鼠腹水中发现高水平的HIF−1α和血管内皮生长因子（VEGF），表明在PDAC扩散到不同组织过程中缺氧信号是活跃的。除了影响淋巴结、肝脏和肺外，PDAC还经常显示血管周围、神经周围和神经内部侵入。调控这些过程的细胞和分子机制尚未确定，需要进一步研究来描述EMT、蛋白酶依赖型侵袭和低氧信号在这些肿瘤扩散途径中的潜在作用[25]。

缺氧是胰腺恶性肿瘤的一个新的决定因素。PC内缺氧能诱导EMT和侵袭，很大程度上是通过促进癌细胞穿过上皮基底膜并开始侵袭。缺氧信号也会影响基质细胞，促进巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞（cancer−associated fibroblasts，CAFs）和PC干细胞（pancreatic cancer stem cells，PSCs）的激活，以及特异性细胞外基质成分的分泌，从而产生广泛性的PDAC的间质[25]。

4 叉头框M1（FOXM1）在胰腺肿瘤侵袭转移中的表达及作用

4.1 FOXM1与尿激酶纤溶酶原激活物（uPA）和尿激酶纤溶酶原激活物受体（uPAR）系统在PC进展中的关系 研究发现FOXM1c在人类PC的两种亚型中占主导地位。此外，FOXM1c在高度转移的人类PC中的表达水平远高于低转移细胞。FOXM1b和FOXM1c通过上调uPA和uPAR的表达促进了PC的EMT和迁移、侵袭和转移；FOXM1a没有这种效果。这些数据表明FOXM1b和FOXM1c在PC发病机制和进展中均发挥重要作用[27]。

uPA和uPAR通过与细胞外基质蛋白以及整合素和其他跨膜受体的相互作用来调控肿瘤细胞和（或）与血管内皮细胞的黏附、迁移和增殖，进而调节肿瘤血管生成和生长。研究证明uPAR的表达水平与PC的FOXM1表达水平直接相关[27]。FOXM1b和FOXM1c增加了PC中uPA和uPAR的表达，而FOXM1的敲除降低了uPA和uPAR的表达。此外，FOXM1直接与uPAR基因的启动子区域结合，并激活其活性，证明了uPAR是FOXM1下游的一个新靶点。鉴于uPAR对PC的进展和FOXM1对uPAR转录调节的重要作用，FOXM1促进PC的发病和侵袭至少部分是通过增加uPAR的表达，表明FOXM1/uPAR通路是新的促进PC进展的信号途径[27]。

4.2 FOXM1与Krüppel样因子4（KLF4）在PC中的表达及相互关系 KLF4是一种与肿瘤抑制和发生相关的转录因子。最近，在FOXM1启动子中发现了一个特定的KLF4结合位点。染色质免疫沉淀实验表明，KLF4可以与FOXM1启动子的这一区域结合[28]。此外，用KLF4表达载体转染PDAC细胞可抑制FOXM1启动子的活性，而敲除KLF4后可显著增加其活性。实验人员检查了KLF4和FOXM1在人类胰腺肿瘤标本中的表达。在大多数标本中，KLF4的表达显著降低，而FOXM1的表达明显增加，对FOXM1和KLF4在胰腺肿瘤表达的分析显示FOXM1表达与KLF4表达呈负相关。这些发现也提示在PC中FOXM1表达受到KLF4的负调控，表明这种新型的KLF4/FOXM1通路的信号失调在PC进展中有重要作用[28]。

4.3 缺氧与FOXM1在PC中的相互作用 缺氧导致人类癌细胞中FOXM1及HIF−1α过度表达。Xia等[29]发现，当细胞缺氧时，癌细胞中FOXM1 mRNA和蛋白表达显著增加。这也证明了HIF−1α可特异性地直接结合到FOXM1的启动子区域的HIF−1α结合位点。但缺氧对PC的FOXM1表达影响的主要机制尚不清楚。

研究表明，在PC转移过程中，从最初的EMT到最终的器官转移的过程，每一步都可以由FOXM1调节，这意味着FOXM1在转移中具有关键作用[28]。FOXM1增强了MMP−2和MMP−9基因表达，从而促进了PC的侵袭，抑制FOXM1的表达导致MMP−2、MMP−9在PC中的表达减少，与肿瘤细胞迁移、侵袭和血管生成的整体减少有关。除了对蛋白溶解相关基因表达的调控外，FOXM1通过促进血管生成和PC的EMT促进了胰腺肿瘤的侵袭和转移[28]。

5 双肾上腺皮质激素样激酶1（DCLK1）在人类PC干细胞中表达

PC在早期发生侵袭和转移。这些恶性行为可能起源于癌症干细胞（CSCs），但是，对潜在的CSCs的作用特别是在侵袭和转移中的作用研究不清楚[30]。既往有关CSCs的蛋白酶体活性研究发现CSCs是高度转移性的，主要定位在肝转移模型的侵袭性肿瘤的边缘处[30]。微阵列和siRNA筛选实验表明，胰腺CSCs主要表达DCLK1且伴随有组蛋白修饰，具有侵袭性和转移潜能。DCLK1的过表达导致了胰腺CSCs变形形态，这促进了PC的迁移。DCLK1的敲除严重抑制了胰腺CSCs的体内肝转移。临床上也发现DCLK1在PC患者转移瘤中过度表达。因此，DCLK1对于CSCs的侵袭和转移的特性是至关重要的，并且可能是人类PC中有潜力的表观遗传和治疗靶点[30]。

6 河马（Hippo）通路上转录协同激活因子（TAZ）促进PC的EMT和进展

具有结构域PDZ结合基的TAZ是Hippo通路的一个传感器，促进肿瘤的发展。研究发现，胰腺肿瘤的TAZ表达明显高于正常胰腺组织；进一步分析TAZ表达与组织微阵列临床病理参数的相关性，发现其表达与肿瘤分化呈正相关；还有，在PC系中，TAZ表达高于胰腺导管上皮细胞，提示在PC中TAZ的活化促进其增殖、迁移、侵袭和EMT[31]。Merlin的表达抑制导致PC中TAZ的异常表达和活化。Merlin是Hippo通路上游的正向调节因子，而TAZ在PC中的致癌作用是由TEA/ATTS域转录因子介导的。

此外，有研究确定了TAZ表达改变对PC上皮和（或）间充质表型的影响，结果显示TAZ的过表达明显降低了E−cadherin的表达，但增加了vimentin（间质表达的标志物）的表达，相反，TAZ的敲除导致了E−cadherin的表达增加，而vimentin的表达减少；综上所述，TAZ作为致癌基因，促进PC的EMT和进展；因此，TAZ可能是PC有效治疗策略的靶点[32]。

7 有转移的PC组织中Farnesoid X受体（FXR）表达上调

FXR是由配体依赖的转录因子核受体超家族成员组成的，其与视网膜的X受体形成异质二聚体。研究发现，PC中FXR在mRNA和蛋白水平均有上调，其过度表达提示患者预后不良[31]。此外，还发现FXR与Sp1呈正相关，两者高表达的患者预后最差，推测可能是通过触发FXR、p38/MAPK和（或）PI3K/AKT信号和磷酸化Sp1，促进PC的发生、发展[33]。

8 L1细胞黏附分子（L1CAM）促进PC的侵袭转移

L1CAM是细胞黏附分子免疫球蛋白超家族中的一员，通常表达于正常的神经组织中。近年来的研究表明，L1CAM在PC细胞中表达异常增多，并且可以与α5−integrin结合，作用于下游TGF−β1/JUK/slug通路，激活下游肿瘤侵袭转移相关因子，介导肿瘤细胞的EMT、耐药性以及异常血管生成等方面的效应，从而促进PC细胞的侵袭转移[34]。

9 热休克蛋白A2（HSPA2）在PC中表达升高

实时定量PCR和Western blot结果显示HSPA2 mRNA和蛋白在PC标本组中的表达量均显著高于癌旁组织。并与PC的分化程度、血管侵犯、TNM分期有显著相关性。有研究证实，低氧诱导因子HIF−1能作为转录因子与HSPA2转录起始位点上游的低氧应答元件HRE相互作用，从而激活HSPA2基因在肿瘤细胞中的表达[35]。HSPA2在PC中高表达与肿瘤的恶性进展、侵袭和转移等行为密切相关。可能在PC的发生发展过程中发挥重要作用[36]。

PC是近几年恶性肿瘤研究热点，以上简要总结了PC侵袭转移机制的主要研究进展，主要集中于miRNAs、缺氧、FOXM1等蛋白分子作用于靶基因或相关信号通路促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、促进血管生成、促进肿瘤细胞EMT，或者改变肿瘤细胞代谢从而促进侵袭和转移，但具体机制仍有待于进一步深入研究。