结肠癌患者SIRT6表达与病理特征的相关性

耿长辉 张春玲 曹珍珍 衣洪天 何苗 黄树民 菅晶晶 高萍

结肠癌是临床常见的消化道恶性肿瘤，发病率高，随着手术、化疗、分子靶向治疗的发展，结肠癌患者近期生存质量得到一定程度改善，但5年远期生存率仍不理想［1］。转录因子和信号通路在结肠癌病理进程中发挥重要作用，Sirtuin蛋白属NAD＋依赖性组蛋白去乙酰化酶，既往报道证实Sirtuin蛋白可通过调控转录因子和信号通路，参与肿瘤细胞DNA修复、细胞增殖及凋亡过程［2］。去乙酰化酶（Sirtuin6，SIRT6）是Sirtuin蛋白的重要成员，有研究显示SIRT6蛋白与肝癌发生发展密切相关，但有关其在结肠癌中的报道尚属少见［3］。本研究纳入60例结肠癌患者作为研究对象，分析SIRT6表达与结肠癌病理特征的相关性，并对其可能的机制做初步探讨，为临床分子靶向治疗提供参考。报道如下。

资料与方法

一、一般资料

纳入2015年4月至2017年4月哈尔滨医科大学附属第五医院普外科60例结肠癌患者作为研究对象。纳入标准：（1）均经组织病理活检和结肠癌根治术确诊；（2）入院前未接受放化疗、内分泌、手术干预及其他治疗；（3）均获得患者同意并签署知情同意书。排除标准：（1）病历资料缺失者；（2）合并有其他恶性肿瘤者。60例患者中男32例，女28例；平均年龄（54.31±12.86）岁；肿瘤位置：乙状结肠17例，降结肠27例，升结肠16例；肿瘤直径（4.27±1.82）cm；分期Ⅰ期17例，Ⅱ期28例，Ⅲ期15例；高分化16例，中分化25例，低分化19例。

二、研究方法

1.Western blot法检测 SIRT6和HIF-1α：（1）设备试剂：显微镜为日本Olympus公司提供的SZ51/SZ61型光学显微镜，MK3酶标仪由上海赛摩科技生物发展有限公司提供。考马斯亮兰蛋白试剂盒由上海斯信生物科技有限公司提供，兔抗人SIRT6和缺 氧 诱 导 因 子 1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）多克隆抗体均由英国Abcam公司提供，超敏ECL化学发光试剂盒由北京科宇深蓝科技有限公司提供；（2）标本采集：均取手术切除的结肠癌组织和癌旁组织标本，癌旁组织标本应距病灶边界5 cm以上，将标本浸泡于10%甲醛溶液12 h后，石蜡包埋切片，4 ℃保存；（3）检测方法：取0.3 cm3样本，以1：5比例依次加入适量Trizol试剂和氯仿。离心后取上层含RNA的水相层，再次离心，去上清液，室温下风干，于-80 ℃保存。采用考马斯亮兰蛋白试剂盒，并利用标准曲线计算蛋白含量。根据蛋白分子量大小配制聚丙烯酰胺分离胶和基层胶，加入适量Marker蛋白，给予80 V/h电泳电压，待样品溴酚蓝指示剂进入分离胶后，将电泳增至110 V/h，当溴酚蓝的蓝色至分离胶底部时，结束电泳。参照跑胶大小，对滤纸和聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜进行裁剪，并将PVDF膜和滤纸浸泡于缓冲液中，将凝胶、PVDF膜置于滤纸间，使各层间无气泡，在65 V/h电流条件下进行电转，2 h后停止。将PVDF膜封闭于5%牛奶封闭液中，孵育1 h后去封闭液，洗涤。将洗涤后的PVDF膜移至一抗溶液，4 ℃孵育过夜。去孵育抗体，用TBST漂洗液洗涤滤膜3次，5～10 min/次。取洗涤后的PVDF膜，再次进行二抗，操作同上。完成后将PDVF膜置于ECL中，曝光显影。

2.免疫组化法检测SIRT6：取结肠癌组织石蜡切片，依次取二甲苯、无水乙醇、乙醇及PBS溶液进行脱蜡处理，用3% H2O2灭活内源性氧化酶后，取出切片，再用PBS溶液洗涤3次，5 min/次，采用微波修复法修复抗原，将切片移至枸橼酸钠缓冲液中，微波加热至沸腾后冷却，重复1次后用PBS洗涤，取切片，封闭10 min。在切片组织中加一抗，4 ℃条件下孵育12 h，洗涤取出后加入二抗，4 ℃下孵育20 min，洗涤后在切片上加适量二氨基联苯胺显色液，在显微镜下取高倍视野（×200）观察切片组织颜色。

三、观察指标

根据Western blot法检测结果记录结肠癌组织和癌旁组织中SIRT6和HIF-1α蛋白表达水平，入院时收集患者性别、年龄基本病例资料，根据手术结果纳入肿瘤位置、直径、TNM分期及分化程度等病理资料，分析SIRT6和病理特征、HIF-1α的关系。根据免疫组化显色结果判断SIRT6蛋白性质［4］，定位于细胞核，阴性：视野内棕黄色肿瘤细胞＜20%，阳性：视野内棕黄色肿瘤细胞≥20%。

四、统计学分析

选用SPSS19.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，组间比较行t检验，计数资料以（%）表示，组间比较行χ2检验，多因素采用Logistic分析，相关性采用直线线性回归分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、Western blot法检测SIRT6蛋白和HIF-1α表达情况

结肠癌组织中SIRT6和HIF-1α分别为（1.87±0.65）和（1.72±0.59），癌旁组织中SIRT6和HIF-1α分别为（2.34±1.13）和（0.84±0.36），两组间比较差异显著（t=2.793，9.862；P=0.006，0.000）。见图 1～4。

二、不同病理特征患者SIRT6蛋白表达差异

60例患者结肠癌组织经免疫组化检测SIRT6蛋白阳性13例，阴性47例，SIRT6不同表达水平患者间肿瘤分期和分化程度差异显著（χ2=7.651，9.346；P=0.022，0.009）。见表 1，图 5～6。

三、SIRT6蛋白表达多因素分析

将差异有统计学意义的指标赋值并纳入多因素分析模型，赋值如下：分期（Ⅰ期=0，Ⅱ期=1，Ⅲ期=2），分化（高分化=0，中分化=1，低分化=2）。经多因素分析显示肿瘤分期是影响SIRT6蛋白表达水平的独立因素（P＜0.05）。见表2。

四、Western blot法检测SIRT6和HIF-1α蛋白表达相关性分析

结肠癌患者癌组织中SIRT6蛋白表达与HIF-1α水平呈显著负相关性（r=-0.819，P=0.000），见图7。

图1 Western blot法检测SIRT6/β-action 图2 Western blot法检测HIF-1α/β-action 图3 SIRT6在结肠癌和癌旁组织中表达 图4 HIF-1α在结肠癌和癌旁组织中表达

表1 不同病理特征患者SIRT6表达差异（例，%）

讨 论

国内有报道显示结肠癌发病率居恶性肿瘤第4位，且呈年轻化趋势［5］，既往报道显示癌胚抗原、癌抗原125、基质金属蛋白酶-2及磷脂酰肌醇激酶-3等分子标志物与结肠癌关系密切，但上述标志物缺乏特异性，均不能用于指导结肠癌分子靶向治疗［6-8］。SIRT6是Sirtuin蛋白的重要成员，具有去乙酰环酶和ADP-核糖基转移酶催化活性作用，可与抑癌因子泛素特异性蛋白酶10协同作用，抑制肿瘤细胞增殖分化，对肿瘤细胞的基因表达、DNA修复及生产代谢过程均具有重要的调节作用［9-11］。

图5 SIRT6在结肠癌组织中阴性表达（×10）图6 SIRT6在结肠癌癌旁组织中阳性表达（×10）

表2 SIRT6蛋白表达多因素分析

图7 SIRT6和HIF-1α相关性分析

本研究采用Western blot法检测结肠癌和癌旁组织中的表达，发现癌组织中SIRT6蛋白表达水平显著低于癌旁正常组织，提示结肠组织中SIRT6蛋白表达水平降低可能存在癌变风险，动物实验显示敲除SIRT6蛋白后小鼠肿瘤数量和大小增加，侵袭性增强［12］，提示SIRT6蛋白对结肠癌进展可能存在保护作用，说明SIRT6蛋白在结肠癌病理进程中发挥重要作用。为此，本研究采用免疫组化法调查结肠癌患者SIRT6蛋白性质，分析SIRT6蛋白和结肠癌病理特征的关系，结果发现结肠癌TNM分期是影响SIRT6蛋白表达水平的独立因素，提示随着肿瘤分期的进展和浸润深度的恶化，SIRT6蛋白表达被抑制，齐佳等［13］还认为SIRT6蛋白在结肠癌基因转录阶段便出现缺失，提示SIRT6蛋白不仅参与结肠癌病理进程，其表达缺失还可能作为结肠癌变的标记物，但这有待进一步大样本证实。另外，糖酵解能力增强是结肠癌患者典型的能量代谢特点［14］，SIRT6高表达能降低皮下脂肪和甘油三酯含量，纠正葡萄糖和胰岛素水平，改善代谢障碍状态。蒲诗云等［15］研究也认为SIRT6能促进氧化磷酸化，这对延缓肿瘤进展具有重要意义，与本文结论一致。

HIF-1α是细胞代谢过程中重要的调控因子，与HIF-1β形成复合物，参与相关信号通路的转录活化，A Prigione等［16］研究发现HIF-1α能上调己糖激酶2和丙酮酸脱氢酶激酶-I表达水平，参与结肠癌发生发展。本研究也显示SIRT6与HIF-1α具有显著负相关性，说明SIRT6可通过调节HIF-1α表达，参与结肠癌病理进展。另有报道显示SIRT6能调节HIF-1α水平，进而启动H3K9去乙酰化，下调其表达水平，抑制肿瘤细胞代谢途径［17］，这可能是SIRT6发挥保护结肠癌进展的作用机制之一。但临床也有报道显示SIRT6可能具有促进肿瘤进展的作用，提示SIRT6可能具有异质性［18］，此外本研究样本量小，研究结果有待大样本证实。

综上，结肠癌SIRT6表达水平与患者临床病理分期具有显著相关性，SIRT6高表达有助于抑制肿瘤进展，这可能与SIRT6蛋白调控HIF-1α水平有关。

[ 1 ] 刘清华, 陈依红.结肠癌根治术后5年无病生存率影响因素分析 [J]. 结直肠肛门外科, 2017, 23(1): 27-31.

[ 2 ] Ueno T, Endo S, Saito R, et al. The sirtuin inhibitor tenovin-6 upregulates death receptor 5 and enhances cytotoxic effects of 5-fluorouracil and oxaliplatin in colon cancer cells [J]. Oncology Research, 2013,21(3): 155.

[ 3 ] 陶娜娜, 周洪钟, 任吉华, 等.Sirtuin 6对肝癌细胞增殖的影响 [J].中国病理生理杂志, 2016, 32(6): 1031-1036.

[ 4 ] 张子杰.结肠癌组织VEGF表达与树突状细胞浸润的临床意义及与血清VEGF浓度及其活化水平的相关性 [J]. 中国免疫学杂志, 2015, 31(9): 1257-1261.

[ 5 ] 张玥, 石菊芳, 黄慧瑶, 等.中国人群结直肠癌疾病负担分析 [J].中华流行病学杂志, 2015, 36(7): 709-714.

[ 6 ] 卢灿荣, 张士武, 张勇, 等.联合检测癌胚抗原、糖链抗原19-9和C反应蛋白对结肠癌的诊断价值 [J]. 标记免疫分析与临床,2012, 19(1): 3-6.

[ 7 ] 陈伟, 王贵玉, 陈瑛罡, 等.1810例左、右半结肠癌临床病理分析 [J]. 中华结直肠疾病电子杂志, 2013, 2(4): 162-165.

[ 8 ] Banday MZ, Sameer AS, Mir AH, et al. Matrix metalloproteinase(MMP) -2, -7 and -9 promoter polymorphisms in colorectal cancer in ethnic Kashmiri population -- A case–control study and a mini review [J]. Gene, 2016, 589(1): 81-89.

[ 9 ] Bakiri L. Liver cancer initiation is controlled by AP-1 through SIRT6-dependent inhibition of survivin [J]. Nature Cell Biology,2012, 14(11): 1203.

[ 10 ] Rizzo A, Iachettini S, Salvati E, et al. SIRT6 interacts with TRF2 and promotes its degradation in response to DNA damage [J]. Nucleic Acids Research, 2016, 45(4): 1820.

[ 11 ] 井浩人, 周毅.miR-33a通过抑制SIRT6的表达促进结直肠癌细胞的增殖 [J]. 临床医学研究与实践, 2017, 2(25): 5-8.

[ 12 ] 周玥, 王亚平, 王建伟, 等.三丁基过氧化氢体外诱导造血干/祖细胞衰老中的SIRT6/NF-κB信号轴 [J]. 中国组织工程研究,2014, 18(37): 5967-5971.

[ 13 ] 齐佳, 崔春晖, 陈日红, 等.SIRT6在结直肠癌组织中的表达及其临床意义 [J]. 安徽医科大学学报, 2017, 52(2): 281-285.

[ 14 ] 来伟, 施景龙, 林显敢, 等.肿瘤抑制基因N-myc下游调节基因2调节结肠癌细胞糖代谢 [J]. 中华实验外科杂志, 2016, 33(11):2533-2534.

[ 15 ] 蒲诗云, 邝江莹, 何金汗.SIRT6在能量代谢中的作用 [J]. 生理科学进展, 2014, 45(6): 448-452.

[ 16 ] Prigione A, Rohwer N, Hoffmann S, et al. HIF1 modulates cell fate reprogramming through early glycolytic shift and upregulation of PDK1-3 and PKM2. [J]. Stem Cells, 2014, 32(2): 364.

[ 17 ] Liu C, Huang Z, Jiang H, et al. The sirtuin 3 expression profile is associated with pathological and clinical outcomes in colon cancer patients [J]. Biomed Research International, 2014, 2014(5795):871263.

[ 18 ] 董振, 雷倩, 刘力超, 等.长寿蛋白SIRT6在肿瘤发生发展中的作用 [J]. 生物工程学报, 2016, 32(7): 870-879.