河南省鸡源粪肠球菌的分离鉴定与耐药性分析

朱雷，李金磊，董鹏，狄元冉，巩丹，张增波

（河南省兽药饲料监察所，河南 郑州 450008）

肠球菌原属于链球菌属，1994年正式被独立为肠球菌属[1]。粪肠球菌是一种革兰氏阳性菌，广泛分布于自然界中，常栖居于人和动物的肠道中，在畜牧业中粪肠球菌常作为益生菌饲料添加剂来调节畜禽肠道菌群，是重要的条件致病菌[2]。近年来，随着抗菌药物和免疫制剂的广泛使用和侵入性治疗机会的增加，使得粪肠球菌成为医院感染的重要病原菌之一[3]，我国医院分离的病原菌中，粪肠球菌位居前3位[4]。在兽医临床研究中，由肠球菌引起的动物疾病也日益增多[5],猪和鸡感染粪肠球菌发病以及死亡的报道也越来越多[6-7]。据研究显示，多重耐药性在肠球菌中已普遍存在，并且变得日益严重[8]，这给人畜临床抗感染治疗带来极大的挑战。作为可以衡量抗菌药物耐药性水平的革兰氏阳性指示菌，对鸡源粪肠球菌的耐药性分析和研究是极其重要的，可以为科学制定抗菌感染防治方案以及细菌耐药性监测提供必要的理论依据。该试验从河南省A、B、C、D4个地区的规模化养鸡场抽取样品进行粪肠球菌分离、鉴定，随后进行耐药性试验，以期掌握河南省鸡源粪肠球菌的耐药情况，为以后的临床用药和粪肠球菌的控制预防提供科学指导依据。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料

1.1.1 菌株

肠球菌标准菌株ATCC 29212，购自中国兽医药品监察所。

1.1.2 样品来源

2016年1月至12月抽取河南省A、B、C、D4个地区规模化鸡场肛门拭子样品180批。

1.1.3 培养基与试剂

革兰氏阳性细菌鉴定板、一次性无菌采样棒（BHI）、K-F链球菌琼脂、营养琼脂、脑心浸液琼脂、革兰氏阳性细菌药敏板。

1.1.4 仪器设备

低温可叠放摇床、细菌浊度仪、全自动细菌鉴定/药敏系统、梯度PCR仪、凝胶成像系统。

1.1.5 引物

粪肠球菌引物P1：5'-ACTTATGTGACTAAC TTAACC-3'，P2：5'-TAATGGTGAATCTTGGTTTGG-3'，扩增片段长度为326bp。

1.2 方法

1.2.1 预增菌

将一次性无菌采样棒采集的样品尽快送到实验室，37℃培养16～20h，同时设阳性和阴性对照。1.2.2 样品的分离、纯化

取预增菌菌液1～2环，划线于K-F链球菌琼脂上，37℃培养（48±2）h，选取单个典型菌落进行纯化，最后将纯化好的菌落划线接种于脑心浸液琼脂培养基。

1.2.3 菌株的鉴定

1.2.3.1 PCR鉴定 用灭菌棉签挑取纯化好的菌落，加入装有无菌生理盐水的1.5ml离心管中，反复冷冻煮沸2～3次，12000rpm离心取上清液作为PCR扩增模板。同时设阳性对照、阴性对照和空白对照。

50μl总反应体系为：预混酶 25μl ddH2O 18μl P1 1μl P2 1μl模板 5μl

反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃后延伸5min；4℃保存。同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照。

PCR结束后，取8μlPCR产物，用1.5%琼脂糖进行电泳，15V/cm电泳20～30min，凝胶成像系统观察结果。

1.2.3.2 鉴定系统鉴定 对PCR鉴定为粪肠球菌阳性的

样品，采用全自动细菌鉴定/药敏系统进一步鉴定。

1.2.4 药敏试验

取营养琼脂上经鉴定的粪肠球菌菌落，用生理盐水调制0.5MCF，吸取10μl加入到10ml肉汤中，然后分别取100μl加入到96孔药敏板中，37℃培养16～20h，读取药敏试验结果。

2 结果

2.1 菌株分离结果

经预增菌培养，KF链球菌琼脂分离纯化，最后经PCR及全自动细菌鉴定/药敏系统鉴定，河南地区规模化鸡场共分离粪肠球菌100株，分离率为55.6%，其中A、B、C、D4个地区分离率分别为70.00%（21/30）、38.90%（35/90）、90.00%（27/30）、56.70%（17/30）。具体情况见表1。

表1 2016年河南省各地区鸡源场粪肠球菌分离情况

2.2 药敏试验结果

分离的100株粪肠球菌对克林霉素、泰妙菌素、青霉素、头孢西丁、磺胺异恶唑、替米考星、红霉素耐药较严重，耐药率分别为100.00%、100.00%、100.00%、98.81%、97.62%、94.05%、92.86%；对头孢噻呋、强力霉素（多西环素）、氧氟沙星耐药相对严重，耐药率均在60%～90%；对万古霉素全部敏感。

2.3 不同地区耐药结果

不同地区耐药结果存在差异，A地区耐药率较其他地区偏高，A、C地区对强力霉素、氧氟沙星、恩诺沙星、复方新诺明的耐药率明显高于B、D地区，D地区对头孢噻呋的耐药率明显低于A、B、C地区，A、B地区对庆大霉素的耐药率明显高于C、D地区。具体结果见表2。

表2 河南省2016年不同地区鸡源粪肠球菌耐药情况

3 讨论

粪肠球菌很易被诱导产生新的耐药性，并且对许多抗菌药物可以产生获得性耐药，如对高水平的氨基糖苷、糖肽类(万古霉素)、β-内酰胺、红霉素、四环素、利福平等，耐药菌株的感染使常规性治疗难以奏效[9]。

该研究通过对河南省规模化鸡场的粪肠球菌进行分离纯化、鉴定以及耐药性试验，共分离粪肠球菌100株，分离率55.60%，与黄雁[10]等研究的福建某鸡场的粪肠球菌分离率为77.80%相比，相对较低，比苏崴艺[11]等从辽宁省鸡场分离率为24.00%要高。这种分离率存在差异，可能是由地区不同、采样时间不同导致的，也可能是不同养殖场环境差异及用药情况不同所致。

分离的100株粪肠球菌对克林霉素、泰妙菌素、青霉素、头孢西丁、磺胺异恶唑、替米考星、红霉素耐药较严重，耐药率均超过90.00%；对头孢噻呋、强力霉素（多西环素）、氧氟沙星耐药相对严重，未发现耐万古霉素菌株。这一结果比张慧[12]等研究的鸡源粪肠球菌对红霉素、庆大霉素的耐药率分别为90.00%和23.70%略高（该试验结果分别为92.86%和36.90%）；比商军[13]等研究的鸡源粪肠球菌对青霉素、红霉素、庆大霉素的耐药率分别为91.30%、91.30%和26.10%略高，（该试验结果分别为100.00%、92.86%和36.90%）。这种耐药率的差异，表明不同动物来源其耐药率存在差异，不同地区、不同养殖环境、不同用药情况均可导致其耐药率不同。

从该次试验结果看，河南省鸡源性粪肠球菌耐药现象已相对较为严重，在今后的管理过程中，应引导养殖企业规范用药，合理用药，营造更好的养殖环境，进一步控制动物源细菌耐药性的产生。

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