SNP检测方法在动物研究中的应用

赵 杰，游新勇，徐贞贞，陈爱亮，赵 燕，何雯菁，杨曙明



SNP检测方法在动物研究中的应用

赵 杰，游新勇，徐贞贞，陈爱亮，赵 燕，何雯菁，杨曙明※

（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081）

单核苷酸多态性（SNP）作为第三代分子标记技术，以其数量丰富、遗传稳定性高、易于快速自动化检测等优点备受关注。该文综述了基于不同原理的SNP分型检测方法，包括几种常见的测序技术、基于酶学及杂交原理的分析检测技术和基于色谱及质谱的相关技术。阐释了方法的原理、分析了方法的优缺点及适用范围。总结了目前在动物遗传育种、亲缘鉴定、动物品种及产品溯源等方面的应用研究现状。为下一步开发更灵敏准确、简便易行、高通量及低成本的SNP检测方法及拓展SNP的应用领域提供参考。

动物；自动检测；产品溯源；单核苷酸多态性（SNP）；分型检测方法；亲缘鉴定

0 引 言

分子标记一般指基因水平上由于DNA分子缺失、碱基及序列的改变等机制而产生的多态性标记[1-2]。目前已发展到以单核苷酸多态性为代表的第三代分子标记技术[3-4]。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）主要是指由于单个碱基的改变引起基因组水平上的DNA序列多态性[5]，当上述变异在群体中所占比例不小于1%时，即为单核苷酸多态，但在cDNA中的特殊情况下也可以小于1%[6]。SNP主要由2种表现形式：一种称为转换，即一个嘌呤被另一个嘌呤所代替，或一个嘧啶被另一个嘧啶所代替；一种称为颠换，即一个嘌呤被一个嘧啶所代替，或者一个嘧啶被一个嘌呤所代替。转换和颠换比例大约为2:1，且多发生在T碱基和C碱基之间[7]。

1 SNP分子标记分类及特点

1.1 SNP分子标记的分类

根据SNP在染色体上所处的位置，分为基因编码区的cSNPs，基因间区的iSNPs及基因周边的pSNP。其中，由于处于外显子内的cSNPs相对保守，其变异率仅为周围序列的20%。根据SNP对遗传效应的影响，SNP也可以分三类，包括错义突变（missence mutation），变异导致翻译时氨基酸的替换，形成的蛋白质或多肽无活性或者功能低下；无义突变（nonsence mutation）：变异形成的多肽链不完整或者没有活性；同义突变（synonymy mutation），变异不会造成蛋白质序列和性质的改变[8]。根据SNP是否处于蛋白编码区分为编码SNP和非编码SNP[9]。

1.2 SNP分子标记的特点

①数量多且分布广，SNPs几乎分布于整个基因组中。研究表明，在人类基因组中其突变率约为1/1 000，整个基因组估计可达300万之多[10]，而在其他哺乳动物中其突变率约为1/500~1/1000[11]。在植物基因组中，其平均密度1/50~/1300[12-13]。②遗传稳定性高，SNPs突变率仅为10-9，相比微卫星等多态性标记遗传稳定性相对较高，结果也更可靠[14-15]。③富有代表性，若突变发生在基因编码区时，可能会直接引起生物体的疾病及遗传改变[16]。④易实现自动化分析，绝大多数SNPs属于二等位基因，分析检测时只需判定其“有或无”，数据分析简单[17]。

2 SNP的检测分析方法

目前，越来越多的简单、快速、高效、高通量的检测方法不断被开发出来。根据研究对象的不同，SNP检测方法主要可以分为针对已知SNP和针对未知SNP进行分析，不过在实际应用过程中，两类方法往往可以结合使用以达目的[18]。根据检测原理的不同，SNP的分型和定量技术归纳起来大致有以下几类：

2.1 测序法

直接测序法是最直接、最准确的方法。该方法对于发现未知的SNP十分有效，位点检出率可达到100%。同时该方法还可区分SNP的突变类型、突变位置[19]。

2.1.1 第一代测序技术

第一代测序中以Sanger发明的双脱氧链末端终止法应用最多。该方法通过设计4个相互独立的反应，利用同位素（32P,35S）进行标记，双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作为链终止试剂，经过DNA聚合酶延伸获得一系列长度不同的DNA片段，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，即可获知目的DNA分子的碱基序列[20]。后经过不断发展，在标记技术上以四色荧光染料对ddNTP进行标记，在分离技术上采用自动化程度和灵敏度更高的毛细管电泳技术。一代测序兼具准确性和读长长的优势，读长已达1kb，且碱基读取率可达99.999%，是确定基因序列的“金标准”。但是，受限于测序通量低、速度慢以及成本高等缺点，仅适用于位点数量及样本量较少的情况。

2.1.2 第二代测序技术

又称下一代测序技术（next-generation sequencing，NGS）。这是对第一代测序技术的划时代变革，真正意义上实现了高通量[21]。目前，用于SNP分型检测的二代测序技术平台主要有：454焦磷酸测序（pyrosequencing），Solexa测序技术和SOLiD测序技术。其基本原理均是边合成边测序[22]。454焦磷酸测序采用循环微阵列法，无需制胶，不需要毛细管分离，也不需要荧光染料和同位素标记，操作简单，定量结果准确，在突变位点检测、基因频率及细菌和病毒分型测定方面应用广泛。但该方法成本高，样品制备较难，当存在同种碱基多聚区时会出现背景信号升高造成无法准确判定分型的情况[23]。Solexa测序技术较与454焦磷酸测序相比更具通量和成本优势。但受限于读长过短，在基因组信息已知的测定中使用频率更高[24-25]。SOLiD测序平台可对单拷贝基因片段进行大规模扩增和高通量并行测序[26]。该技术显著的优点是具有双碱基编码技术的误差矫正功能，准确率大于99.94%，但度长更短。

2.1.3 第三代测序技术

二代测序技术有其高通量优势，但是PCR扩增、荧光分析等方面制约着测序的成本和效率，且读长短，后续的序列拼接、组装及注释等生物信息学的分析困难[27]。在此情况下，基于单分子读取技术的第三代测序技术有广阔的应用前景。其优点在于数据读取速度更快，无需PCR扩增，不会带来累积效应，成本也得以降低。对于需要高分辨率的SNP检测、甲基化识别、以及含有大量SNP的遗传学领域基因定位等第一及第二代测序技术无法胜任的领域潜力巨大[28-29]。

2.2 基于酶学的检测方法

2.2.1 内切酶技术（endonuclease digestion）

该方法的原理基于DNA序列的微小变化，包括位点的产生或消失均会导致内切酶酶切位点发生变化。利用限制性内切酶处理不同个体产生的片段长度不同，再经电泳分离片段，从而检测出突变位点的情况[30]。基于该原理的检测技术主要有限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性（RAPD）、引物入侵分析技术（invader assay）和UCAN（RNase H）等。其中RFLP和RAPD是两种技术相对成熟，需要条件相对简单，大多数实验室都可应用。不过，该方法操作较为复杂，无法进行多重反应，通量低，仅适合于存在酶切位点的SNP情况。

2.2.2 寡核苷酸连接分析（oligo nucleotide ligation assay, OLA）

该技术也称为连接酶检测反应（ligase detection reaction, LDR）。试验首先进行目标序列的扩增并将产物变性为单链，加入两条3′端分别可以与一种基因型互补的特异性检测探针，及与SNP的另一侧模板完全匹配的荧光标记探针。在DNA连接酶的作用下，当左右两条检测探针与目标片段完全互补，且探针间没有空隙时连接反应顺利进行，否则连接反应失败，上机测序，实现对SNP位点的检测[31]。寡核苷酸连接技术基于杂交和链接反应，具有双重保证，分型结果更准确。同时该方法适用于任何多态性位点，位点检测率高，且可以进行多重反应。属于中等通量的分型方法，目前在SNP与疾病相关的研究方面应用较多。

2.2.3 等位基因特异性PCR (allele-specific PCR, AS-PCR)

又名ARMS (amplification refractory mutation system)。该方法利用Taq酶无3′→5′外切酶活性，当引物3′末端与模板发生错配时，Taq酶的延伸速率将会降低或停止，而正常配对的引物可以顺利扩增出产物。扩增产物通过电泳分离后，即可判定样本的基因型[32-33]。该方法易于操作、成本低廉，对仪器设备要求不高，还可以与real-time PCR、毛细管电泳等技术联用实现实时、高通量的检测，目前在动植物遗传育种及临床疾病诊断方面应用较多。适于已知SNP位点的分型测点，特异性的引物设计是成功的关键[34]。

2.3 基于杂交的检测方法

2.3.1 动态等位基因特异杂交（dynamic allele specific hybridization, DASH）

该方法是将PCR产物与标记有荧光染料的寡核苷酸探针杂交，利用存在错配碱基的异源双链变性温度低于不含错配碱基的同源双链的特性，随着温度逐渐升高，异源双链先于同源双链到达变性温度，双链变性，荧光强度迅速减弱，基于此可判定是否存在碱基突变[35]。具有结果准确、快速、通量高、自动化等优点，但是对扩增产物质量要求高，需要专门的仪器设备。

2.3.2 Taqman探针法

又称核酸外切酶法（5′-nuclease assay），基于Taq酶具有5′端外切酶活性，利用两条普通引物及一条包含有待检SNP位点的等位基因特异性探针进行测定。探针5′端标记荧光基团，3′端标记荧光猝灭基团。延伸过程中，Taq酶将与目标序列完全互补的探针的荧光基团切割，使荧光基团和猝灭基团得以分离产生荧光信号。如果探针与靶序列之间存在错配，荧光强度将会大大降低，因此可以根据反应液中荧光的强度来判断突变类型[30]。该技术的突出优点是无需分离和洗脱等后续步骤，检测速度得以大大提升。但是需要针对不同的SNP位点设计不同的探针，探针费用较高。要保证探针的准确性难度较高，无法进行多重反应，在应用过程中受到一定限制。

2.3.3 基因芯片技术

基因芯片是一种高度集成化、微型化及自动化的SNP检测技术。该技术将针对已知SNP位点设计的探针固定在固相载体上，将扩增后的DNA单链与之杂交，完全互补配对则发出强的荧光，否则荧光强度即会很弱，利用荧光显微仪器进行扫描，获得检测结果[30]。该方法在基因组中实现了快速、高通量的SNP检测，其应用范围非常广。但是，目前商业化芯片种类有限，有的还需定制，价格昂贵。同时，芯片的杂交条件受DNA序列中GC含量影响，实际操作过程中需要注意。

2.4 其他检测技术

2.4.1 变性高效液相色谱（denaturing high performance liquid chromatograph, DHPLC）

又称温控高效液相色谱法，是基于单链构象多态性检测和变性梯度凝胶电泳2种方法而发展起来的突变检测技术，其分离原理类似于阴离子交换层析，带负电荷的DNA分子与带正电荷的分离柱相结合，通过温度调节使DHPLC在接近DNA分子的值下运行，若经PCR扩增后的双链存在错配碱基则更易变性，在分离柱上保留时间短，易被洗脱，从而与正常的配对双链分开，色谱图上表现为2个或多个色谱峰，最后根据色谱峰的峰型或数目来确定SNP的有或无[36-37]。该方法自动化程度及特异性高，还可同时设定多个温度以增加突变碱基的检出率。特别适于低频率突变的检测及大批样本的初步筛查。该方法自动化程度高，检测变异敏感性及特异性高，且能同时实现片段纯化。但是，分离柱精密，对试剂及样品均有较高要求，所需费用较高。此外，它只能检测到位点的有无，无法确定碱基突变情况及其所在位置，因而还需进一步的测序鉴定。

2.4.2 基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）

该方法是在引物的5′端引入生物素，使变性的单链产物可共价结合于硅芯片上，在硅芯片上进行引物的退火、延伸反应，由于突变部位与正常部位配对的碱基不同，在质谱仪上即出现不同的质谱峰[38]。一个样本经质谱分析仅需几秒钟，且结果准确，但需要对分析样本进行纯化处理后才可上机测定。目前，通过化学修饰替代了纯化步骤，检测的时间和成本均大幅度下降。

3 SNP在动物研究中的应用

3.1 SNP在动物遗传育种中的应用

近年，随着DNA分子标记技术的不断发展，分子标记辅助育种已经成为一种新的育种方法在生产实际中发挥越来越重要的作用，该方法利用分子标记与目标性状的紧密连锁关系，通过分子标记的选择间接实现对目标性状的选择。克服了传统形态学标记数目少、受环境影响较大以及抽样误差带来的育种准确性差的不足，且可以在育种早期实施性状鉴定，大大缩短育种周期，降低育种成本。

3.1.1 动物遗传图谱构建

SNP标记的丰富性更有利于高密度遗传图谱的构建。遗传图谱包含的标记越多，分布越均匀，其精度也就越高，越有利于精准定位性状基因[39]。王光凯[40]利用Illumina OvineSNP50K芯片数据构建了绵羊的全基因组选择信号图谱，发现多个基因家族与毛色、角型、骨骼和肌肉生长发育、繁殖、免疫和毛囊生长发育相关。刁淑琪等[41]采用猪Illumina Porcine SNP60K芯片对216个杜洛克猪进行基因型分析，结果表明，该群体不同染色体间平均连锁不平衡程度介于0.46至0.59之间，且连锁不平衡水平随着标记间距的增加而衰减，变异程度随之减小，为杜洛克猪遗传分析及全基因组选择研究提供参考。Wang等[42]构建了平均标记间隔为0.3958 cM的大菱鲆（L.）遗传连锁图谱，共发现220个QTLs（数量性状定位）与不同生长期的体长和体重相关。Tsai等[43]对大西洋鲑鱼（Atlantic Salmon）构建了高密度SNP连锁图谱，并利用该连锁图谱完善了参考基因组，为鲑的基因及基因组研究提供了重要的资源。

3.1.2 标记辅助选择

利用SNP进行标记辅助选择（marker-assisted selection, MSA）较QTL定位相比，更有利于实现单个碱基变异与表型性状的关联分析，更趋于精细定位。钟昕等[44]对包括4个黄牛品种（秦川牛、鲁西牛、南阳牛和郏县红牛）的共计459个个体采用PCR-SSCP技术对基因第8外显子进行SNPs多态性检测，结果表明不同基因型在体高、腰高、体长方面存在显著差异，可以作为黄牛标记辅助选择的候选基因。吴晓平[45]采用Illumina BovineSNP50（54 K）牛全基因SNP芯片，对中国荷斯坦奶牛群体的29个个体进行全基因组关联分析，检测到59个与体型性状显著相关的SNP位点，并定位了多个与体型容量、体深、胸宽、蹄角度、棱角性、后肢侧视、乳头长度和大小的相关的关键候选基因。徐珍[46]选取猪的、、和-基因进行SNPs检测，结果发现基因5′端调控区转录起始位点上游―532bp处有一插入型SNP，且该位点与背膘厚性状呈极显著相关（<0.01）；同时在1，2和-3基因中也分别发现了与出生质量（<0.05），背膘厚、眼肌高、眼肌宽、色值和大理石评分等显著相关（<0.01）的位点，为重要经济性状的分子标记辅助选择提供了理论依据。Sharma等[47]在-、和-基因中均发现了新的与印度Jamunapari山羊出生质量相关的新SNPs位点。宋永利等[48]采用PCR-SSCP方法检测牛孕激素受体第4、8外显子及5′UTR的SNP多态性，发现位于第4外显子的突变与种公牛的射精量显著相关，位于第8外显子的突变对冻精活精子比率和精子密度有影响，表明牛孕激素受体SNP与精液品质存在相关性，对选育肉用种公牛提供了理论依据。

3.2 SNP在动物亲缘鉴定方面的应用

近年来，亲缘鉴定在育种实践中对于谱系划分具有重要作用。Heaton等[49]采用分布于牛18条常染色体及2条性染色体上的32个高度多态的SNP组合进行亲缘关系判断，在美国杂交牛群体中2个随机个体具有相同基因型的概率为2.0×10-13，在纯种安格斯牛中的概率为1.9×10-10。同时，该组标记对于2个群体的非父排除概率分别为99.9% 和99.4%。郭立平[50]采用MAF（最小等位基因频率）为0.4818、期望杂合度为0.4998、多态信息含量为0.3748的包含50个SNP标记组合，在母本基因型未知情况下，其累计排除概率为0.9989。该结果有助于错误谱系的纠正，准确估计育种值具有重要意义。Rohrer等[51]从80个SNP位点中筛选出MAF>0.15的60个位点，用于美国纯种杜洛克、汉普夏猪、兰德瑞斯猪和约克夏猪组成的155个公猪群体，其种间身份同一性的概率为4.6×10-23，种内其概率从4.3×10-14（汉普夏猪）到2.6×10-22（约克夏猪），同时该标记组合也对于其他品种猪也可以进行亲缘关系判定。另外，该应用在解决民事纠纷、侦破刑事案件及保护珍惜动物种质资源等方面也发挥越来越重要的作用。

3.3 SNP在动物品种及产品溯源中的应用

动物品种及其产品溯源是食品整个供应链中不可缺少的一部分，对于保障食品安全、保障公众健康、增加消费者信心具有重要意义。同时，良好的溯源管理体系也有利于地方特色产品的保护，对于假冒产品查处，建立公平的竞争环境，维护市场秩序具有重要作用[52]。

3.3.1 SNP用于个体溯源鉴定

SNP用于个体溯源鉴定不但可以对活体动物进行识别，还可以对分割肉块甚至对加工后的熟肉产品进行溯源判定，较传统溯源技术更具准确性和可靠性。由于SNP的二态性，理论上一个SNP可以区分3个动物个体，个位点组合则可区分3个个体。但是应用于溯源鉴定的位点还需满足以下2个条件：一是在目标群体里具有高度的多态性，以保证其足够的区分能力；二是数量上要足够，以达到更准确的溯源效果。因此，SNP用于溯源应用的首要工作即是筛选得到一组有效的位点组合，并利用匹配概率（match probability）值来衡量该组合的效果，所谓匹配概率是指2个随机个体具有相同基因型的概率，该值越小，2个随机个体被误判的几率越小，表明所选SNP组合区分效果越好。

Orrù等[53]筛选了一组包含18个SNP的位点组合，用于意大利、丹麦常见的6个牛种群的528个个体进行识别。结果表明该组合对于个体的匹配概率依品种的不同，从百万分之1.39 到 0.07。Wu等[54]采用7个多态性的SNP标记组合对中国西北和华东地区的肉羊进行溯源验证，其匹配概率为1.85‰。近年，中国在猪肉产品溯源方便的研究也有了不少报道，如吴潇等采用SNP对上海一屠宰场的猪肉产品进行了溯源应用研究，18个SNP标记组合能有效区分100个个体。同时，随机抽取的10个个体的组织样品都能通过基因型比对找到对应的个体来源[55]。

3.3.2 品种溯源鉴定

品种溯源鉴定对于名优特产品的保护具有重要意义[56-57]。Negrin等[58]筛选出90个多态性的SNP位点对来自意大利、法国、西班牙、丹麦、荷兰、瑞士和英国的24个品种的1047个牛肉样品进行地理区域溯源。牛个体对其原国籍的正确符合率为90%。其中对于地理标志产品—纯高原牛肉的正确率为100%，意大利“Vitellonedell' Appennino Centrale”牛肉的正确率为97%。Dimauro等[59]利用SNPs标记对21个不同的绵羊群体（20个意大利群体及1个斯洛文尼亚群体）的496个个体同原产地进行判别。分别选择包括110和108个2组高度多态的SNPs标记组合，它们能够分别判定该21个绵羊群体及所属的5个地理区域。Cheong等[60]采用90个SNP位点组合成功地将韩国本地肉牛品种Hanwoo同进口牛肉及国产荷斯坦牛区分开，保护了本国的牛肉产业和维护了消费者的知情权。

4 结论与展望

SNP分型检测方法的不断进步为进一步发现新的SNP位点、更精准地确定SNP功能及不断扩展新的应用领域提供了强有力的技术支撑。未来，SNP的分型检测方法将向更高效、更准确、更灵活的方向发展。

SNP作为新一代分子标记技术，因其数量丰富，遗传稳定性高，易于自动化分型等诸多优点，引发了广大研究者的浓厚兴趣，新的高通量检测方法也不断被开发出来。理想的SNP分型方法应同时具备以下优点：1）操作简单，可实现自动化；2）通量灵活，可根据需要加以选择；3）分析速度快，数据处理容易；4）适应性强，对样本要求不高；5）结果可靠，费用可接受。然而，目前的检测方法还不能完全满足以上要求。未来，SNP的检测分型方法应根据适用范围，在更擅长的领域做更精细的提升，如在高通量应用领域，应该更着眼于获得数据的有效性；在中等通量的应用领域，更多考虑到中小型试验及临床应用需求；在现场快速检测领域，应朝着简便、快速、便携式方向发展。同时，生物、物理、化学等相关领域技术的不断进步，一定会为理想的检测方法提供更多的技术革新。

随着SNP分型检测方法不断取得新的突破，SNP的研究应用领域也将持续向深度和广度推进。目前，距离SNP大规模走向应用还存在一些挑战：如在遗传育种方面，由于同一性状往往是多个基因共同决定，所以仍需要进一步确定位点与表型间的显著相关性，才能依据检测的SNP位点进行表型筛选，指导育种实践，从而获得理想的经济性状；在动物品种鉴定及产品溯源方面，由于各研究样本群体遗传背景不同，不同群体间位点的适用性还有待进一步考察，要想获得理想的普适的标记组合，还需通过不断完善标记的筛选策略及扩大代表性群体的数量来实现。不过，随着研究的不断深入、相关领域数据库的逐步建立，SNP的研究应用将逐步走向成熟。

[1] 姚红伟，张立冬，孙金阳，等. DNA分子标记技术概述[J]. 河北渔业，2010(7)：42－46.

Yao Hongwei, Zhang Lidong, Sun Jinyang, et al. Summary of DNA molecular marker technology[J]. Heibei Fishery, 2010(7): 42－46. (in Chinese with English abstract)

[2] 许云华，沈洁. DNA分子标记技术及其原理[J]. 连云港师范高等专科学校学报，2003(3)：78－82.

Xu Yunhua, Shen Jie. DNA Molecular markers techniques and their principles[J]. Journal of Lianyungang Teachers College, 2003(3): 78－82. (in Chinese with English abstract)

[3] 闫华超，高岚，李桂兰. 分子标记技术的发展及应用[J]. 生物学通报，2006，41(2)：17－19.

[4] 单雪，王秀利，仇雪梅. 分子标记及其在海洋动物遗传研究中的应用[J]. 生物技术通讯，2005，16(4)：463－466.

Shan Xue, Wang Xiuli, Qiu Xuemei. Molecular genetic markers and their applications in marine animal genetics[J]. Letters in Biotechnology, 2005, 16(4): 463－466. (in Chinese with English abstract)

[5] 唐立群，肖层林，王伟平. SNP分子标记的研究及其应用进展[J]. 中国农学通报，2012，28(12)：154－158.

Tang Liqun, Xiao Cenglin, Wang Weiping. Research and application progress of SNP markers[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2012, 28(12): 154－158. (in Chinese with English abstract)

[6] 杨昭庆，洪坤学，褚嘉佑. 单核苷酸多态性的研究进展[J]. 国外医学：遗传学分册，2000，23(1)：4－8.

[7] 张小波，何慧，吴潇，等. 基于SNP标记的肉类溯源技术[J]. 肉类研究，2011，25(5)：40－45.

Zhang Xiaobo, He Hui, Wu Xiao, et al. A review of meat traceability technology based on SNP markers[J]. Meat Research, 2011, 25(5): 40－45. (in Chinese with English abstract)

[8] 李宁. 动物遗传学[M]. 北京：中国农业出版社，2015：84－85.

[9] Gottgens B, Barton L M, Gilbert J G, et al. Analysis of vertebrate SCL loci identifies conserved enhancers[J]. Nature Biotechnol, 2000, 18: 181－186.

[10] 罗怀容，施鹏，张亚平. 单核苷酸多态性的研究技术[J]. 遗传，2001，23(5)：471－476.

Luo Huairong, Shi Peng, Zhang Yaping. Detection for single nucleotide polymorphisms[J]. Hereditas, 2001, 23(5): 471－476. (in Chinese with English abstract)

[11] Sachidanandam R, Weissman D, Schmidt S C, et al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms[J]. Nature, 2001, 409(6822): 928－933.

[12] 李兆波，吴禹，王岩，等. SNP标记技术及其在农作物育种中的应用[J]. 辽宁农业职业技术学院学报，2010，12(3)：8－9.

[13] Kanazin V, Hope T, Deven S. Discovery and assay of single nucleotide polymorphisms in barley ()[J]. Plant Molecular Biology, 2002, 48(5): 529－537.

[14] Brumfield R T, Beerli P, Nickerson D A, et al. The utility of single nucleotide polymorphisms in inferences of population history[J]. Trends Ecol Evol, 2003, 18(5): 249－256.

[15] Seki S, Kawaguchi Y, Chiba K, et al. A functional SNP in CILP, encoding cartilage intermediate layer rotein, is associated with susceptibility to lumbar disc disease[J]. Nature Genet, 2005, 37: 607－612.

[16] 汪维鹏，倪坤仪，周国华. 单核苷酸多态性检测方法的研究进展[J]. 遗传，2006，28(1)：117－126.

Wang Weipeng, Ni Kunyi, Zhou Guohua, Approaches for SNP genotyping[J]. Hereditas, 2006, 28(1): 117－126. (in Chinese with English abstract)

[17] Rieder M J, Taylor S L, Tobe V O, et al. Automating the identification of DNA variations using quality-based fluorescence re-sequencing: Analysis of the human mitochondrial genome[J]. Nucleic Acids Res, 1998, 26(4): 967－973.

[18] 许家磊，王宇，后猛，等. SNP 检测方法的研究进展[J]. 分子植物育种，2015，13(2)：475－482.

Xu Jialei, Wang Yu, Hou Meng, et al. Progress on detection methods of SNP[J]. Molecular Plant Breeding, 2015, 13(2): 475－482. (in Chinese with English abstract)

[19] 谢浩，赵明，胡志迪，等. DNA测序技术方法研究及其进展[J]. 生命的化学，2015，35(6)：811－816.

Xie Hao, Zhao Ming, Hu Zhidi. Research of the methods for DNA sequencing technology and its progress[J]. Chemistry of Life, 2015, 35(6): 811－816. (in Chinese with English abstract)

[20] 郝甜甜，李强飞，李国治，等. 测序技术的研究进展[J]. 畜牧与饲料科学，2014，35(3)：78－81.

Hao Tiantian, Li Qiangfei, Li Guozhi, et al. Research progress on the sequencing technologies[J]. Animal Husbandry and Feed Science, 2014, 35(3): 78－81. (in Chinese with English abstract)

[21] Metzker M L. Sequencing technologies-the next generation[J]. Nat Rev Genet, 2010, 11: 31－46.

[22] Zhou Xiaoguang, Ren Lufeng, Li Yuntao, et al. The next-generation sequencing technology: A technology review and future perspective[J]. Sci China: Life Sci, 2010, 53(1): 44－57.

[23] Thomas P, Niedrin G, Denitsa M, et al. Landscape of next-generation sequencing technologies[J]. Anal Chem, 2011, 83, 4327－4341.

[24] Shen Wei, Tian Ye, Ran Tong, et al. Genotyping and quantification techniques for single-nucleotide polymorphisms[J]. Trends Anal Chem, 2015, 69: 1－13.

[25] Pop M, Salzburg S L. Bioinformatics challenges of new sequencing technology[J]. Trends Genet, 2008, 24(3): 142－149.

[26] 陆才瑞，邹长松，宋国立. 高通量测序技术结合正向遗传学手段在基因定位研究中的应用[J]. 遗传，2015，37：765－776.

Lu Cairui, Zou Changsong, Song Guoli. Recent progress in gene mapping through high-throughput sequencing technology and forward genetic approaches[J]. Hereditas, 2015, 37: 765－776. (in Chinese with English abstract)

[27] 杨春晓，张玉，师少军. SNP基因分型检测技术及应用进展[J]. 中国药师，2016，16(6)：811－816.

[28] 张得芳，马秋月，尹佟明. 第三代测序技术及其应用[J]. 中国生物工程杂志，2013，33(5)：125－131.

Zhang Defang, Ma Qiuyue, Yin Tongming. The third generation sequencing technology and its application[J]. China Biotechnology, 2013, 33(5): 125－131. (in Chinese with English abstract)

[29] 赵广荣，扬帆，元英进. 单核苷酸多态性检测方法的新进展[J]. 遗传，2005，27(1)：123－129.

Zhao Guangrong, Yang Fan, Yuan Yingjin. Progress in detection methods of single nucleotide polymorphisms[J]. Hereditas, 2005, 27(1): 123－129. (in Chinese with English abstract)

[30] 高秀丽，景奉香，杨剑波，等. 单核苷酸多态性检测分析技术[J]. 遗传，2005，27(1)：110－122.

Gao Xiuli, Jing Fengxiang, Yang Jianbo, et al. Detection for single nucleotide polymorphisms[J]. Hereditas, 2005, 27(1): 110－122. (in Chinese with English abstract)

[31] 王强，李卫真，张永云. SNPs技术的研究进展及应用[J]. 四川畜牧兽医，2010(8)：31－33.

Wang Qiang, Li Weizhen, Zhang Yongyun. Advance in single nucleotide polymorphism and its application[J]. Sichuan Animal & Veterinary Sciences, 2010(8): 31－33. (in Chinese with English abstract)

[32] Newton C R, Graham A, Heptinstall L E, et al. Analysis of any point mutation in DNA, the amplification refractory mutation system (ARMS)[J]. Nucleic Acids Res, 1989, 17: 2503－2516.

[33] 王清瑶，饶华春，刁勇，等. 等位基因特异性扩增法在SNP 分型中的研究进展[J]. 生物技术通报，2103(12)：62－67.

Wang Qingyao, Rao Huachun, Diao Yong, et al. Recent development of allele-specific amplification in SNP genotyping[J]. Biotechnology Bulletin, 2103(12): 62－67. (in Chinese with English abstract)

[34] Kwok S, Kellogg D E, Mckinney N, et al. Effects of primer-template mismatches on the polymerase chain reaction：human immunodeficiency virus type 1 model studies[J]. Nucleic Acids Res, 1990, 18: 999－1005.

[35] 曾朝阳，熊炜，沈守荣，等. 利用动态等位基因特异性杂交技术进行单核苷酸多态高通量分型[J]. 生物化学与生物物理进展，2002，29(5)：806－810.

Zeng Zhaoyang, Xiong Wei, Shen Shourong, et al. High-throughput single nucleotide polymorphisms genotyping by dynamic allele-specific hybridization[J]. Prog Biochem Biophys, 2002, 29(5): 806－810. (in Chinese with English abstract)

[36] 仪军玲，李彩霞，胡兰. 单核苷酸多态性及其检测方法[J]. 证据科学，2008，16(6)：757－763.

Yi Junling, Li Caixia, Hu Lan. Single nucleotide polymorphisms and detection approaches[J]. Evidence Science, 2008, 16(6): 757－763. (in Chinese with English abstract)

[37] Butcher L M, Meaburn E, Liu L, et al. Genotyping pooled DNA on microarrays: A systematic genome screen of thousands of SNPs in large samples to detect QTLs for complex traits[J]. Atmospheric Chemistry & Physics, 2011, 10(10): 2127－2143.

[38] 常培叶，赵平. 单核苷酸多态性检测方法研究进展[J]. 中国老年学杂志，2015，35(16)：4720－4722.

[39] 张戈，张元跃. SSR和SNP在畜禽育种中的应用进展[J]. 畜牧兽医科技信息，2007(7)：7－9.

[40] 王光凯. 绵羊全基因组连锁不平衡分析和选择信号检测[D]. 北京：中国农业科学院，2014.

Wang Guangkai. Genomic Linkage Analysis and Detection of Selection Signatures on Sheep[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2014. (in Chinese with English abstract)

[41] 刁淑琪，罗元宇，蔡迪，等. 杜洛克猪全基因组连锁不平衡分析[J]. 广东农业科学，2016，43(11)：116－121.

Diao Shuqi, Luo Yuanyu, Cai Di, et al. Genome-wide linkage disequilibrium analysis in Duroc pigherd[J]. Guangdong Agricultural Sciences, 2016, 43(11): 116－121. (in Chinese with English abstract)

[42] Wang W J, Hu Y L, Ma Yu, et al. High-density genetic linkage mapping in Turbot (L.) based on SNP markers and major sex- and growth- related regions detection[J]. PLoS ONE, 2015, 10(3): e0120410.

[43] Tsai H Y, Robledo D, Lowe N R, et al. Construction and annotation of a high density SNP linkage map of the Atlantic Salmon () genome[J]. Gene Genomes Genetics, 2016, 6: 2173－2179.

[44] 钟昕，昝林森，王洪宝，等. 黄牛基因外显子的多态性及其与体尺性状的关系[J]. 西北农业学报，2010，19(7)：12－16.

Zhong Xin, Zan Linsen, Wang Hongbao, et al. Polymorphism of exon 8 ofgene and its relationship with body measurement traits in cattle[J]. Acta Agriculturae Boreali- occidentalis Sinica, 2010, 19(7): 12－16. (in Chinese with English abstract)

[45] 吴晓平. 基于SNP芯片和全测序数据的奶牛全基因组关联分析和基因组选择研究[D]. 北京：中国农业大学，2014.

Wu Xiaoping. GWAS and Genomic Prediction based on Markers of SNP-Chips and Sequence Data in Dairy Cattle Populations[D]. Beijing: China Agricultural University, 2014. (in Chinese with English abstract)

[46] 徐珍. 猪，1，2和3基因SNPs检测及其与生产性状的关联分析[D]. 武汉：华中农业大学，2016.

Xu Zhen. SNPs Detection and Their Association Analysis with Production Traits of Porcine,,and-Genes[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2016. (in Chinese with English abstract)

[47] Sharma A, Dutt G, Sivalingam J, et al. Novel SNPs in,andgenes reveal significant association with growth traits in Indian goat breeds[J]. Small Ruminant Research, 2013, 115: 7－14.

[48] 宋永利，刘伟英，张丽颖，等. 牛孕激素受体SNP分析及其与精液品质的关系[J]. 畜牧与兽医，2010，42(1)：32－35.

Song Yongli, Liu Weiying, Zhang Liying, et al. SNP analysis of progesterone receptor gene and its relationship with semen quality in bulls[J]. Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2010, 42(1): 32－35. (in Chinese with English abstract)

[49] Heaton M P, Harhay G P, Bennett G L, et al. Selection and use of SNP markers for animal identification and paternity analysis in US beef cattle[J]. Mamm Genome, 2002, 13: 272－281.

[50] 郭立平. 利用微卫星和SNP标记对西门塔尔牛进行亲子推断的研究[D]. 北京：中国农业科学院，2013.

Guo Liping. Parentage Testing with Microsatellite and SNP Markers in Simmental[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2013. (in Chinese with English abstract)

[51] Rohrer G A, Freking B A, Nonneman D. Single nucleotide polymorphisms for pig identification and parentage exclusion[J]. Animal Genetics, 2007, 38: 253－258.

[52] 张小波，吴潇，何慧，等. 基于SNPs标记的猪肉DNA溯源技术的研究[J]. 中国农业科技导报，2011，13(3)：85－91.

Zhang Xiaobo, Wu Xiao, He Hui, et al. Studies on DNA technology for pork traceability based on SNPs markers[J]. Journal of Agricultural Science and Technology, 2011, 13(3): 85－91. (in Chinese with English abstract)

[53] Orrù L, Catillo G, Napolitano F. Characterization of a SNPs panel for meat traceability in six cattle breeds[J]. Food Control, 2009, 20: 856－860.

[54] Wu Qiayu, Zhou Guanghong, Yang Sasa, et al. SNP genotyping in sheep from northwest and east China for meat traceability[J]. Journal of Consumer Protection and Food Safety, 2017, 12(2): 125－130.

[55] 吴潇，吕贝贝，王金斌，等. 猪肉产品SNP 溯源标记的研究及应用[J]. 食品科学，2017(online). http://kns.cnki.net/ kcms/detail/11.2206.TS.20170303.1523.174.html

Wu Xiao, Lü Beibei, Wang Jinbin, et al. The research and application of pork traceability system based on SNP markers[J]. Food Science, 2017(online). http://kns.cnki.net/ kcms/detail/11.2206.TS.20170303.1523.174.html (in Chinese with English abstract)

[56] 魏益民，郭波莉，魏帅，等. 食品产地溯源及确证技术研究和应用方法探析[J]. 中国农业科学，2012，45(24)：5073－5081.

Wei Yimin, Guo Boli, Wei Shuai, et al. The principle of food geographical origin traceability and authenticity technique[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2012, 45(24): 5073－5081. (in Chinese with English abstract)

[57] Todea A, Roian I, Holonec L, et al. Legal protection for geographical indications and designations of origin for agricultural products and foodstuffs[J]. Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca, 2009, 66: 463－466.

[58] Negrini R, Nicoloso L, Crepaldi P, et al. Traceability of four European protected geographic indication (PGI) beef products using single nucleotide polymorphisms (SNP) and Bayesian statistics[J]. Meat Science, 2008, 80: 1212－1217.

[59] Dimauro C, Nicoloso L, Cellesi M, et al. Selection of discriminant SNP markers for breed and geographic assignment of Italian sheep[J]. Small Ruminant Research, 2015, 128: 27－33.

[60] Cheong H S, Kim L H, Namgoong S, et al. Development of discrimination SNP markers for Hanwoo (Korean native cattle)[J]. Meat Science, 2013, 94: 355－359.

Review on application of SNP detection methods in animal research

Zhao Jie, You Xinyong, Xu Zhenzhen, Chen Ailiang, Zhao Yan, He Wenjing, Yang Shuming※

(100081,)

Single nucleotide polymorphism (SNP) is just a single base change in a DNA sequence, including transition, transversion, insertion or deletion of one base, and it is usual with an alternative of two possible nucleotides at a given position. It is also considered as the least frequent mutation in the biological genome, with the frequency of 1% or greater, and the mutation is widespread in the genome. SNP is usually bi-allelic mutation, which is liable to high-throughput automated analysis and genotyping. In addition, SNP is relative genetically stable than other mutations, such as simple sequence repeat (SSR), estimated to be between 1×10-9and 5×10-9per nucleotide per year at neutral positions in mammals. SNP is considered as the third generation of molecular marker, and it is very popular in both overseas and domestic scholars in many fields of research. In recent years, the methods for SNP quantification and genotyping are rapidly developed and so many new analytical techniques are renewed. The first type of genotyping and quantification technique is sequencing, such as Sanger sequencing, next generation sequencing and the third-generation sequencing. The sequencing technique can directly get the sequence information of the target fragment by comparing between sequences each other, and the detection rate can be reached to 100%. What’s more, the information of mutation type and location can be clear at the same time. The allele-specific enzymatic techniques and allele-specific hybridization-based techniques are the second type of genotyping and quantification techniques. These techniques utilize the characteristics of subtle difference in thermal stability between perfectly matched and one-base mismatched in the sequences to design different detective methods and adopt corresponding detectors. The types of method include endonuclease digestion technique, oligo nucleotide ligation assay technique, allele-specific PCR technique, dynamic allele specific hybridization technique, Taqman, DNA chip technique and so on. These approaches have realized the high throughput beyond doubt, however, due to the enzymatic and hybridization theories, in order to achieve good results, the optimal condition of PCR reaction and the carefully designed probes and hybridisation protocols are of great importance. Besides the above SNP genotyping and quantification techniques, the chromatography and mass spectrometry techniques are also employed in the field, such as denaturing high performance liquid chromatograph and MALDI-TOF-MS. The two methods are all ultra-high-throughput screening and high efficient SNP detection methods. But they are too expensive to be widely used by most researchers. Although each technique is not perfect, researchers can choose one or two suitable methods to solve their scientific problems. With the rapid development in SNP typing and improvement of relevant databases, SNP has been extensively employed in genetic studies, such as genetic maps construction, population genetics structural analysis, genetic association studies, breed and individual identification and product traceability. We hope that this article will provide some references for the SNP genotyping and quantification techniques towards to the more robust, flexible and low-cost for further development.

animals; automatic testing; trace analysis; single nucleotide polymorphism; genotyping and quantification techniques; parentage testing

2017-07-23

2018-01-10

北京市科技计划课题（No. Z161100000616008）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（No. 1610072017010）

赵杰，博士生，研究方向为农产品质量安全检测及评价研究。Email：zhaojie20090127@126.com

杨曙明，男，研究员，博士，博士生导师，主要研究方向为畜产品质量和安全。Email：yangshuming@caas.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2018.04.037

S8; Q52

A

1002-6819(2018)-04-0299-07

赵 杰，游新勇，徐贞贞，陈爱亮，赵 燕，何雯菁，杨曙明. SNP检测方法在动物研究中的应用[J]. 农业工程学报，2018，34(4)：299－305.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.04.037 http://www.tcsae.org

Zhao Jie, You Xinyong, Xu Zhenzhen, Chen Ailiang, Zhao Yan, He Wenjing, Yang Shuming. Review on application of SNP detection methods in animal research[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2018, 34(4): 299－305. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.04.037 http://www.tcsae.org