泛素-蛋白酶体在运动调节骨骼肌代谢中的作用研究进展

杨立坤 傅力 牛燕媚

1天津医科大学康复医学系（天津300070）2天津医科大学基础医学院（天津300070）

有氧运动可促进机体能量代谢平衡，预防肥胖症、2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）等多种代谢性疾病的发生发展，但其中机制尚不完全清楚。运动后，骨骼肌细胞会发生适应性改变，如增加糖原储存、促进新的蛋白质合成。研究发现，骨骼肌收缩可增加细胞蛋白质（如受损蛋白、错误编码蛋白、错误折叠蛋白等）降解、调节肌细胞转录因子活性，此过程也伴随着泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）的激活[1-3]。UPS是调控细胞蛋白质降解的重要途径之一。细胞内的UPS将蛋白质降解为小分子多肽，蛋白水解酶可进一步将多肽分解为氨基酸，促进氨基酸池的更新，从而增加蛋白质的从头合成（De novosynthesis）[4]。目前，UPS与骨骼肌代谢之间的联系尚不明确。因此，深入探究运动与UPS之间的关系可有助于揭示运动改善代谢性疾病的潜在机制。

1 泛素-蛋白酶体系统概述

UPS广泛存在于真核细胞，是一种依赖三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的非溶酶体型蛋白质降解系统。UPS由泛素活化酶（ubiquitin-activating enzyme，E1）、泛素结合酶（ubiquitin-conjugating enzyme，E2）、泛素连接酶（ubiquitin-protein ligating enzyme，E3）及26S蛋白酶体组成。在催化过程中，三种酶共同作用将小分子泛素（ubiquitin，Ub）标记到底物蛋白，此过程即为泛素化反应。底物蛋白可经此反应形成单泛素化、多泛素化及多聚泛素化以行使不同的功能[5]。在人类基因组中，编码E1的基因只有一种，编码E2的基因约40种，而编码E3的基因超过600种[6，7]。作为UPS中最关键的酶，E3连接酶被分为三个家族：RING（really interesting new gene）家族、HECT（the homology to E6AP C terminus）家族和 RBR（the RING-between-RING）家族。RING家族可催化泛素从E2转移到蛋白分子上[8]，而HECT家族和RBR家族则先将泛素转移到E3活化半胱氨酸位点，再催化泛素与底物蛋白结合[9]。

E3连接酶呈组织特异性分布，肌肉组织（包括心肌、平滑肌、骨骼肌）中有两种特异性E3连接酶：MuRF1（muscleRING finger1，MuRF1）和 MAFbx（muscle atrophy F-box protein，MAFbx/Atrogin-1）。MuRF1是一种RING finger型E3连接酶，属于TRIM超家族的亚群之一，其特征是存在NH2-末端三联基序：RING结构域、锌指B盒结构域和富含亮氨酸的卷曲螺旋结构域[5]。MAFbx与MuRF1同属于Cullin-Ringbased E3-Ligases（CRLs），是一种SCF蛋白复合物。在其结构中，F-box发挥特异性识别作用，能使特定底物蛋白与E2相互作用，完成底物蛋白的泛素化[10]。Cullin是SCF复合物中的骨架蛋白，连接Skp和小RING finger结构域Rbx1（RING-box protein1），促使泛素共价结合到底物蛋白的赖氨酸残基[8]。26S蛋白酶体是分子量为2.0 MDa的多亚基蛋白酶，可识别多聚泛素化的底物蛋白，大量存在于胞浆和胞核内，占细胞内总蛋白质的1%左右，主要由20S蛋白酶体和19S调节复合物组成。19S调节复合物可展开底物蛋白的三级结构，将其转移到20S蛋白酶体降解为2～10氨基酸的多肽。最终，蛋白水解酶将小分子多肽彻底降解为氨基酸。

2 泛素-蛋白酶体在运动调节骨骼肌代谢中的作用

2.1 UPS与PGC- 1 α

过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1，PGC-1α）属核转录辅助激活因子，广泛存在于线粒体含量丰富的组织，如心肌、骨骼肌、肝脏、棕色脂肪组织（brown adipose tissue，BAT）等。在真核细胞中，PGC-1α起到促进线粒体生物合成、糖和脂肪酸氧化代谢的作用。研究发现，PGC-1α敲除小鼠表现出骨骼肌细胞线粒体数目减少、运动能力下降，骨骼肌易疲劳，并且适应性产热（non-shivering thermogenesis）能力严重受损[11]。PGC-1α还可促进核呼吸因子1和2的表达（nuclear respiratory factor 1 and 2，Nrf1&Nrf2），从而增加线粒体转录因子（mitochondrial transcription factor A，mtTFA）和线粒体呼吸链相关蛋白表达，调节线粒体的生成[12]。作为细胞能量供应站，线粒体是细胞内葡萄糖、脂肪代谢的关键场所。骨骼肌细胞过表达PGC-1α-b（PGC-1α的一种主要亚型）可促使小鼠骨骼肌细胞线粒体生成增加，脂肪酸受体CD36、肉毒碱棕榈酰转移酶1（carnitine palmitoyltransferase 1，CPT1）等脂代谢关键蛋白均显著增高，脂代谢增强，小鼠最大摄氧量和运动速度也显著提高[13]。

最新研究表明，UPS可调控骨骼肌细胞PGC-1α的含量，而耐力运动增加PGC-1α蛋白表达可能与其蛋白稳定性增加、UPS降解PGC-1α减少有关[14，15]。研究发现，过表达过氧化物酶体增殖物激活受体β（peroxisome proliferator-activated receptor-β，PPARβ）显著增加了细胞线粒体总量和PGC-1α含量，而PGC-1α基因表达量并无显著变化[16]。Koh等采用电穿孔技术在胫骨前肌细胞中导入过表达PPARβ质粒后发现，胫骨前肌PGC-1α与泛素分子结合显著降低，PGC-1α蛋白含量显著增加[14]。离体C2C12肌原细胞实验发现，过表达的PPARβ大量结合到PGC-1α，有效减少了PGC-1α与泛素结合[14]。上述结果提示PPARβ通过减少UPS对PGC-1α降解，增加了PGC-1α蛋白含量。为验证运动在调节PPARβ/PGC-1α中的作用，研究人员对大鼠进行为期2周的游泳运动干预，运动结束24h后检测骨骼肌相关蛋白，发现骨骼肌PPARβ增加2.5倍，PGC-1α、线粒体酶、Nrf1也随之增加。然而，抑制骨骼肌PPARβ后，线粒体酶和Nrf1显著降低，PGC-1α蛋白含量降低了50%～70%[14]。

综上所述，PGC-1α在细胞能量代谢过程中发挥重要作用，而UPS可调节PGC-1α蛋白含量，运动可能通过增加PPARβ与PGC-1α结合、防止UPS降解PGC-1α，从而发挥促进细胞线粒体生物合成，调节骨骼肌细胞能量代谢的作用。

2.2 UPS与HDAC 4/ 5

组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）分为4类，其中第Ⅱ类HDACs又分为a型和b型两种亚型，HADC4/5/7/9属于a型，而HDAC6及HDAC10属于b型。研究发现组蛋白乙酰化修饰与染色质结构和DNA转录调控密切相关：乙酰化程度低的组蛋白区域，染色质表现为紧凑、非转录激活状态；而在常染色质高度乙酰化的组蛋白区域则呈现出松散、转录活跃的状态[17]。HDAC4/5等Ⅱ类a型HDACs单独存在时并没有去乙酰化酶活性，需要通过C端去乙酰化酶结构域募集拥有催化活性的HDAC3复合物来行使其功能[18]。研究发现，在运动调控骨骼肌糖代谢过程中，HDAC4/5起到重要作用，骨骼肌中特异性敲除HDAC4/5会引起Ⅰ型肌纤维（氧化型）显著增加，小鼠抗疲劳能力增强[2]。进一步研究发现，其机制可能是与下调的HDAC4/5解除了对肌细胞增强因子2（myocyte enhancer factor 2，MEF2）DNA序列结合区的抑制作用有关[2]。MEF2是骨骼肌细胞葡萄糖转运子4（glucose transporter 4，Glut4）基因的重要启动子之一，而Glut4是骨骼肌细胞转运葡萄糖的关键蛋白，Glut4的缺失或功能障碍会导致细胞糖稳态失调，引发胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）、T2DM 等疾病[19，20]。我们的前期研究也证明，运动可通过激活腺苷酸活化蛋白激酶α2（AMP-activated protein kinase α2，AMPKα2） 抑制 HDAC4/5，促进Glut4向细胞膜转位，进而改善IR[21]。

有氧运动可能通过两种机制对HDAC4/5进行调控：一种是依赖于运动激活骨骼肌细胞内一些激酶磷酸化HDAC4/5介导的出核作用；另一种可能是促进UPS对HDAC4/5的降解作用[2，18]。研究人员发现在慢肌纤维中Ⅱ型HDACs半衰期（Half-life）较短[2]。为探明其机制，研究人员在体外培养的C2C12肌细胞中加入环己酰亚胺（cycloheximide，一种蛋白合成抑制剂），4小时后发现相比于对照组HDAC5含量显著降低，而加入MG132（蛋白酶体抑制剂）后，HDAC5的降解作用被显著抑制，HDAC4/5的泛素化水平显著提高，逆转了HDAC5的下降，提示UPS降解HDAC5。研究人员随后用一种HDAC5的核定位信号（nuclear localization signal，NSL）突变体HDAC5-K270R重复上述实验，其泛素化水平和蛋白水平并没有变化。而在融合了SV40-核定位信号（SV40-NSL）后，HDAC5-K270R恢复了核转位功能，泛素化水平再次升高。上述研究提示Ⅱ型HDACs是运动调控骨骼肌糖代谢的重要靶点，运动可通过激活激酶减少Ⅱ型HDACs对DNA的抑制作用，而UPS也可能起到协同作用，从而促进MEF2和Glut4基因表达，改善骨骼肌糖摄取能力和IR。

3 调节骨骼肌泛素-蛋白酶体系统的信号通路

3.1 FoxO 1/ 3

人体骨骼肌细胞叉头框O家族蛋白（forkhead box class O family proteins，FoxOs）是一类重要的转录因子家族，分为四种亚型，即 FoxO1、FoxO3、FoxO4、FoxO6。其中FoxO1/3是骨骼肌细胞蛋白质降解的关键调节因子，可调控细胞UPS及自噬-溶酶体途径（autophagy-lysosomal pathway）[22]。研究证实，FoxO1和3是骨骼肌特异性E3连接酶MuRF1和MAFbx的转录因子[23，24]。在过表达FoxO1的小鼠骨骼肌细胞研究中发现，参与调控肌萎缩的相关基因表达均显著增高，骨骼肌质量丢失，导致运动能力受损[23]。而在禁食诱导骨骼肌萎缩模型中，研究人员用电穿孔技术将RNAi导入骨骼肌细胞，抑制骨骼肌细胞FoxO1/3表达，小鼠骨骼肌萎缩显著改善，同时MAFbx的表达抑制[24]。阿霉素（doxorubicin，DOX）是临床常用的抗癌药物，长期使用会对心肌和骨骼肌带来的严重副作用。在DOX诱导的小鼠骨骼肌萎缩动物模型发现运动可对抗DOX引起的骨骼肌萎缩，且降低心肌和骨骼肌细胞FoxO1和MuRF1的表达[25]。推测FoxOs可能是调控骨骼肌细胞蛋白分解代谢的重要因子，有望作为今后相关药物开发的潜在靶点。

3.2 活性氧簇（reactive oxygen species ，ROS）

ROS是细胞在有氧代谢过程中产生的一系列活性氧簇，包括O2、H2O2、O2-、·OH等。线粒体是细胞内ROS产生的重要场所。葡萄糖等营养物质通过有氧氧化途径进入三羧酸循环，在代谢过程中产生的氢离子在线粒体呼吸链蛋白的作用下进一步生成ATP和水，同时产生ROS[3]。研究发现，小鼠制动所引起的比目鱼肌萎缩与血浆ROS含量增加有关，给予ROS抑制剂别嘌呤醇治疗明显抑制p38丝裂原活化蛋白激酶-MAFbx（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）和核因子-κB-MuRF-1（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）两条信号通路的活性，在此过程中比目鱼肌的萎缩程度减少了20%[26]。此外，单次高强度运动可显著提高小鼠腓肠肌脂质过氧化物丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，增加机体氧化应激反应。而腹腔注射抗氧化剂Trolox可逆转这一效应，MAFbx、MuRF1 mRNA表达水平降低，减少了骨骼肌泛素连接酶的表达[27]。综上所述，ROS可能是激活骨骼肌细胞UPS的重要因素，减少ROS可有效抑制UPS的作用效果。

3.3 肿瘤坏死因子-NF- κ B途径

肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor alpha，TNFα）和NF-κB是细胞参与炎症反应及凋亡的重要因子。在胆道梗阻性肝炎小鼠模型中，小鼠骨骼肌MAF-bx和MuRF-1 mRNA含量显著增高，伴随着肌球蛋白重链泛素化增多、20S蛋白酶体的活性也增高，骨骼肌出现明显萎缩[28]。而小鼠被注射TNFα受体抑制剂后MAFbx和MuRF1 mRNA显著降低，骨骼肌萎缩得到改善，提示TNFα是MAFbx和MuRF1的上游信号分子。肥胖机体处于长期慢性炎症状态，而有氧运动能够有效改善肥胖等代谢相关疾病。临床研究发现，让心衰患者进行运动治疗后可显著降低骨骼肌细胞TNFα、IL-6、IL-1β水平，减少骨骼肌炎症状态、改善心衰患者的骨骼肌萎缩[29]。TNFα也可增加鼠类同源泛素结合酶E220k（ubiquitin carrier protein and homologue of murine E220k，UbcH2）的表达，研究人员在UbcH2的启动子区域发现NF-κB结合位点，提示TNFα -NF-κB通路可调节UbcH2表达[30]。以上结果说明在炎症状态下TNFα可激活骨骼肌UPS，引起骨骼肌萎缩，而抑制其活性可改善骨骼肌质量。

4 小结

蛋白质是细胞生命功能的单位，UPS作为细胞内降解蛋白质的重要途径调控细胞代谢相关蛋白质的降解。MAFbx/MuRF1是骨骼肌细胞特异性E3连接酶，在骨骼肌萎缩发生和发展过程中发挥重要作用。目前在骨骼肌细胞尚未完全发现E3连接酶的靶蛋白，筛选靶蛋白的相应E3连接酶也是研究的重点和难点之一。作为机体重要的代谢组织，揭示骨骼肌细胞代谢相关蛋白的调节机制可为今后肥胖、T2DM等代谢相关疾病的治疗提供新的思路。