Sestrins在运动防治肿瘤发生发展过程中的作用研究进展

陈美平 张媛 傅力

天津医科大学基础医学院（天津 300070）

1 Sestrins

Sestrins（Sesns）是一类高度保守的应激诱导蛋白，主要感受应激性压力，包括DNA损伤、氧化应激和缺氧。Sesns可清除细胞内过量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）堆积，以保护细胞免受活性氧簇的攻击[1]。大量研究已证实，Sesns通过调节细胞氧化应激、炎症反应、自噬活性和内质网应激等，在维持机体代谢稳态、延缓衰老和抑制肿瘤发生过程中发挥着重要作用[2]。Sesns的分子量52-57 kDa，在人和脊椎动物中主要有三种亚型，包括Sesn1（Sesn1或 PA26），Sesn2（Sesn2或Hi95）和Sesn3（Sesn3）。而多数无脊椎动物，例如果蝇体内只包含一种dSesn亚型[3，4]。现已证明，人类Sesn2（hSesn2）的晶体结构包含两个与生理功能密切相关的伪对称球状亚结构域，其N-末端结构域的氧化还原酶基因序列使hSesn2具有还原烷基过氧化物自由基的功能[5]。而目前对于Sesn1和Sesn3结构的研究相对较少。由于Sesns的表达调控与氧化还原反应之间的密切相关性，人们一直试图揭示Sesns抗氧化应激作用的机制。

早期研究发现，Sesn1和Sesn2的表达受抑癌基因p53的调节，而Sesn3的表达受叉头转录因子O亚型（FOXO）的调节[6]。随着研究的进展，Sesns表达的其他调控因子包括核呼吸因子（NRF2），JNK/c-Jun信号通路和低氧诱导因子-1（HIF-1）信号也被相继发现[7-9]。而Sesns的下游调控机制主要为两方面，一方面作为抗氧化剂，通过促进过氧化物还原酶与亚磺酸还原酶活性的再循环来减少ROS的产生，从而发挥细胞对抗ROS的作用；另一方面Sesns通过多种途径参与调节哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）活性进而调控蛋白质合成、脂质代谢和自噬活性等，在机体生长发育和代谢调节方面发挥重要作用[5，10]。

2 Sestrins与肿瘤

自Sesns作为p53调节蛋白被发现以来，人们对Sesns与肿瘤关系的研究逐步深入。有研究发现，在溃疡性结肠炎患者的结肠组织中Sesn2表达显著升高，而在结肠癌发生时，p53失活的同时Sesn2的表达也缺失。并且，双敲除Sesn2和Sesn3基因的小鼠的结肠更容易发生炎症[11]。这些研究结果表明，Sesns可能具有保护细胞免受损伤刺激、防止癌症发生的作用。此外，在Sesn2对非小细胞肺癌（NSCLC）患者预后评价的研究中，通过RT-PCR和western blot检测NSCLC及相应的非癌组织中Sesn2的mRNA和蛋白表达，结果显示NSCLC组织中Sesn2的表达显著低于相对应的非癌变肺组织，且其低表达与肿瘤分化程度、TNM分期及淋巴结转移与否密切相关，而Sesn2高表达患者的总体生存期比低表达患者长[12]。此外，Sesns还能在一定程度上拮抗肿瘤细胞对放疗、化疗的抵抗作用[13，14]。

氧化应激指ROS和活性氮簇（reactive nitrogen species，RNS）代谢失衡，细胞对ROS、RNS和其它代谢反应中间产物清除能力下降，氧化系统和抗氧化系统平衡失调，从而导致组织损伤。肿瘤的发生与机体代谢失衡、氧化应激和基因毒性密切相关，细胞发生癌变是由于致癌因素的刺激，细胞代谢活性异常和线粒体功能障碍等引起细胞内ROS应激增加，如果细胞抗氧化能力不足以清除过量产生的ROS和RNS，将使组织细胞易受氧化损伤[15]。而Sesns作为细胞抗氧化应激的重要调节因子，其失活可能难以抵消ROS的大量积聚导致而肿瘤发生。有研究发现，在肿瘤细胞中抑制Sesns基因的表达会导致基因突变、基因不稳定和肿瘤转移生长[16]。而且，在肿瘤细胞系中，Sesns蛋白现已证实可使氧化型过氧化物酶基因（peroxiredoxin，Prx）再生，依赖N-甲基-D-天冬氨酸受体的激活阻止氧化应激过程[17]。Sesns蛋白可恢复过氧化Prx的活性，但Woo等报道其并不作为一种酶直接参与这一过程，而是仅仅起着辅助性作用[18]。总之，Sesns的抗氧化应激作用在抑制肿瘤发生发展过程中具有重要作用。

3 Sestrins抗氧化应激抑制肿瘤的作用机制

3.1 Sestrins通过AMPK/mTOR/mTOR途径启动细胞自噬

目前已有大量研究广泛认可AMPK/mTOR信号传导途径介导的Sesns通过对抗氧化应激，影响蛋白质的合成、细胞生长和增殖来调控肿瘤的进展[19]。

p53作为肿瘤抑制因子，可在基因损伤和氧化应激下被诱导，参与细胞周期抑制，促进凋亡前细胞活动，并且影响细胞代谢调节[20]。研究发现，p53可通过AMPK/mTOR途径启动细胞自噬，而Sesns作为p53下游基因，参与这一调控途径[21]。自噬是一种经典的细胞内能量代谢和自我更新机制，能降解细胞内变性和过量的蛋白质及损伤的细胞器并回收利用，这对保护活细胞逃离能量缺乏、氧化、内质网应激等应激压力具有重要的作用[22]。最近一系列研究显示，p53在自噬调控中具有双重作用，当在细胞质中积累时可以作为自噬的抑制剂，而向细胞核内转运后会诱导包括Sesns在内的自噬相关基因。研究人员用防己诺林碱（Fangchinoline）处理肝HepG2和PLC/PRF/5细胞，发现p53被特异性地募集到细胞核，选择性地触发Sesn2的表达，从而刺激了AMPK信号的转导[23]。AMPK属于丝/苏氨酸蛋白激酶，是细胞内重要的能量代谢和营养感受器，同时也是肿瘤抑制因子肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）的效应物，具有调节能量稳态、细胞极性和细胞周期的作用。有研究通过免疫沉淀发现Sesns与MCF7乳腺癌细胞AMPKα1β1γ1三聚体及其上游的调节因子LKB1直接相互作用，使用Flag标记的Sesn2表达载体或稳定整合的四环素诱导增强Sesn2表达，可增加AMPKα1和AMPKβ1的亚基磷酸化，并与磷酸化AMPK-Thr127共定位于胞浆。而且，Sesn2表达增加可以激活细胞LKB1和AMPK，以及LKB1、AMPKα 1和AMPKβ1的mRNA水平。此研究还发现，广泛使用的电离辐射（IR）癌症疗法可以增加Sesn2表达并激活AMPK从而维持基因组完整性并抑制肿瘤发生[13]。这一调节效应提示，Sesns可通过AMPK依赖性自噬在氧化应激情况下对细胞发挥保护性作用，从而表现出对肿瘤的抑制作用。

Sesns激活AMPK途径可以抑制mTORC1促进自噬，参与调控代谢、衰老及抑制肿瘤[19]。mTOR是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，细胞内存在mTORC1和mTORC2两种不同的复合体。mTORC1整合了生长因子刺激、能量状态、氨基酸和氧的利用等有关信号，参与蛋白质、脂质和细胞器的生物合成等代谢活动，一方面通过增加内质网应激、线粒体代谢和 ROS产生，阻断细胞凋亡和自噬抑制分解代谢过程，另一方面受损线粒体的积累也可导致超氧化物产生，从而刺激了肿瘤的发生[24]。而mTORC1的活化能增加Sesns基因的转录，可能是通过激活转录因子如p53，HIF-1，FoxO，正CCAAT/增强子结合蛋白β（CCAAT/enhancer binding protein beta，C/EBP-β）和激活转录因子（activating transcription factor 4，ATF4）等在内质网应激和氧化应激下游起作用[25]。Sesns作为 mTORC1信号传导的负反馈调节因子，通过两条途径负向调节mTORC1的活性，其中一条途径是AMPK介导的，另一条途径是Rag蛋白。在AMPK途径中，AMPK的激活可磷酸化结节性硬化复合物（tuberous sclerosis complex，TSC2），后者作为mTORC1正向调控子Rheb的抑制蛋白，可使与活化的三磷酸鸟苷（Guanosine triphosphate，GTP）结合的Rheb转化为与失活的二磷酸鸟苷（Guanosine diphosphate，GDP）结合的形式，使Rheb失活，从而负性调控mTORC1[8，25]。而在 Rag 蛋白途径中，Sesns通过抑制Rag依赖的mTORC1溶酶体易位而抑制mTORC1的活性，此途径也称氨基酸感应途径[26，27]。这些研究结果有助于进一步加深对Sesns抗氧化功能的认识，Sesns通过调节mTORC1发挥抗氧化损伤、阻断凋亡途径和自噬抑制及 ROS堆积等肿瘤刺激信号，从而抑制肿瘤的发生发展。

除此之外，在防己诺林碱诱导自噬过程的研究中发现，使用AMPK抑制剂会下调自噬的发生，而mTOR抑制剂则不会产生此效果，这表明AMPK活化在诱导肿瘤细胞自噬过程中是必需的，但其诱导自噬可能无需通过mTOR信号转导[23]。最近一项研究表明，有些AMPK活化剂可以通过mTOR非依赖性方式激活AMPK信号传导并影响蛋白质降解[28]。总之，Sesns可激活AMPK、抑制mTOR，从而激活细胞线粒体自噬，清除由自噬功能下降产生的功能缺陷型线粒体、过量ROS以及代谢物堆积，恢复线粒体功能以维持细胞活性氧稳态，这一过程对肿瘤的发生发展产生抑制作用。

3.2 Sestrins激活Nrf2途径而起到抗氧化剂的作用

Nrf2作为一种转录因子，具有调控细胞新陈代谢、细胞增殖和蛋白质折叠的作用，在多种抗癌研究中被鉴定为不同抗氧化酶的诱导剂，其激活可导致一些抗氧化基因如超氧化物歧化酶-2（SOD-2）、血红素加氧酶-1（HO-1）等的表达，并减弱由氧化应激造成的细胞损伤。另一方面，在正常生理条件下Nrf2也能通过特异性地抑制细胞产生某些非吞噬细胞氧化酶（nonphagocytic cell oxidase，NOX）降低活性氧，发挥维持机体动态平衡的作用[29]。Nrf2在肿瘤的发生发展过程中作用较为复杂，对机体的保护作用主要集中在Nrf2对致癌物诱导的肿瘤发生起到预防作用[30]。

胞质接头蛋白Keap1是一种富含半胱氨酸的蛋白质，作为Cul3-Rbx1 E3泛素连接酶复合物和Nrf2泛素化的底物衔接子，调节Nrf2的活性。小鼠在体实验研究发现，肝细胞中Sesn2和p62同时上调可促进Keap1的自噬降解，从而激活Nrf2信号；而Sesn2的缺失会阻断单纯p62增加引起的Keap1降解和Nrf2激活，同时小鼠肝脏对氧化损伤的易感性增加[31]。在非应激条件下，Keap1同源二聚体两个亚基的Kelch重复结构域与Nrf2的Neh2（Nrf2-ECH homology2）结构域区DLG和ETGE两个序列相结合，从而出现Nrf2的泛素化[32]。然而，当细胞暴露于氧化剂或亲电子试剂时，Keap1在一个或多个残基处发生修饰并发生构象变化，破坏其与Nrf2低亲和性DLG基序的相互作用，从而削弱其调节Nrf2的泛素化能力，此时Nrf2为抵抗胞浆内降解而易位至细胞核并激活转录[31，32]。由于p62与Keap1和自噬相关蛋白LC3结合力以及Sesns同时与p62，Keap1和Rbx1的结合力，Sesns和p62在自噬体中一起隔离Keap1和Cul3-Rbx1复合物，促进Keap1降解，从而激活Nrf2及其下游各种抗氧化酶基因的转录。同时，p62和Sesn2基因也是Nrf2的靶标，p62和Sesn2的积累与Nrf2的激活构成正反馈环路[30]。因此，Sesn2通过促进Keap1降解正向调控Nrf2这一途径同样体现了Sesns的抗氧化功能，且其抗氧化剂作用在肿瘤的防治中具有重要意义。

3.3 Sestrins通过抑制HIF-1途径抑制肿瘤

HIF-1α是调控低氧适应性反应中血管生成、糖酵解及pH平衡的主要转录因子，在持续缺氧条件下，细胞通过HIF-1α正向调控多种基因而生存，且目前已确定近100种与血管生成、肿瘤耐药及侵袭转移等组织恶性病变相关基因受HIF-1α调控[33]。当细胞环境氧充足时，HIF-1α被泛素-蛋白酶体途径迅速降解，HIF-1ɑ在脯氨酸402和564位被脯氨酸羟化酶（PHDs）羟基化是启动HIF-1α泛素化的必要条件；而在缺氧条件下，PHDs的活性受损，使HIF-1α变得稳定并与HIF-1β（也称为芳香烃受体核移位蛋白，ARNT）形成异源二聚体转位至细胞核，HIF-1α还调节反应元件（HRE）驱动的基因转录；由于肿瘤细胞经常处于缺氧微环境，HIF-1通常在癌细胞中过度表达并积累，HIF-1介导的信号转导也被认为是调节实体瘤代谢和生长的关键途径[9]。

研究发现，在小鼠气管上皮细胞处于缺氧状态时，Sesn2的转录激活独立于p53而由HIF-1激活。而在一些细胞类型中，缺氧状态下Sesn2的诱导又独立于HIF-1，因此可以推测，在多数情况下，Sesn2的转录诱导并非缺氧本身的作用，而是长期缺氧导致能量缺失的结果[34]。在研究Sesn2对缺氧状态下肿瘤的病理生理影响时发现，Sesn2在HEK293细胞中的过度表达通过抑制HIF-1α而抑制肿瘤的生长发育，主要表现在腺病毒-Sesn2（Ad-SESN2）感染以过表达Sesn2可减少CoCl2诱导低氧反应元件（HRE）-荧光素酶活性和HIF-1α驱动基因的表达水平及HIF-1α在结直肠癌细胞中的积累。该研究还发现 Ad-SESN2感染的细胞在血清诱导的细胞迁移中表现出抗转移作用，而AMPK的显性失活（dominant negative，DN）形式恢复了Ad-SESN2介导的HIF-1α积累的抑制作用。此研究还提示，Ad-SESN2感染是通过增加了PHD介导HIF-1α的羟化作用，从而导致HIF-1α的泛素化和最终蛋白酶体降解，它还可以阻断HIF-1α依赖性靶基因包括GLUT1、VEGF、CA-IX、LDHA 和 PDK1的表达，而AMPK信号是Sesn2介导的抑制HIF-1α和体外细胞迁移所必需的，即Ad-SESN2介导HIF-1α的积累抑制和癌细胞迁移可能是由于AMPK的激活[9]。同时，低氧状态下生物体内ROS的产生可以导致HIF-1的积累，而Sesn2作为一种保护线粒体和代谢应激的新型抗氧化酶，通过维持线粒体膜电位、ADP/ATP比率和线粒体DNA含量抑制ROS过度生产，从而降低HIF-1水平[35]。这一结果进一步诠释了Sesns感受由于缺氧导致的氧化和代谢压力，通过AMPK-PHD调节增加HIF-1α的降解，这有助于抑制体内外肿瘤的发生和转移[9]。

4 Sesns在运动抑制肿瘤发生发展中的作用

运动作为健康生活方式的重要组成部分，参与机体多种生理功能的调节，且对多种慢病的发生起预防作用。流行病学资料表明，运动能够减少各种肿瘤的风险，尤其是乳腺癌和结肠癌，而且在有关乳腺癌、结肠癌和前列腺癌的研究中发现，体力活动的干预方式与患者总体生存率呈剂量依赖性正相关。以上这些运动对肿瘤产生的积极影响表明，运动能够抑制肿瘤的发生、发展和转移[36]。目前，已有的基础和临床研究均提示，运动可能通过调节性激素、机体代谢和免疫等全身性因素参与肿瘤的调控过程[37，38]。此外，也有研究表明运动能够直接调节肿瘤的内在生理因素，包括其自身的生长、代谢、转移和免疫原性[39]。由于Sesns能够感受氧化应激、清除细胞内过量的ROS堆积、保护线粒体及维持机体代谢平衡，且其抗氧化作用与肿瘤密切相关[16，19]，我们推测Sesns可能通过参与运动调控肿瘤的途径发挥抗氧化应激的作用，从而抑制肿瘤的发生和发展过程。

p53作为肿瘤抑制因子，参与细胞周期停滞、分化、衰老、静止和凋亡过程，抑制错误DNA的复制[20]，同时也是调节氧化代谢、自噬和线粒体生物合成过程的蛋白质靶标，越来越多的研究证据也提示p53在运动适应性反应中的作用[40]。啮齿动物骨骼肌的研究表明，急性运动可诱导p53从细胞核转移到线粒体，与线粒体转录因子A（Tfam）相互作用以正向影响mtDNA转录[41]。而Tachtsis等的研究发现，耐力运动后细胞核p53的丰度选择性增加，提示细胞为清除受损的细胞器和蛋白质而发生了自噬反应[42]。Sesns作为p53作用的下游调控靶点，可激活AMPK、抑制mTORC1、诱导自噬，在抑制肿瘤发生中具有潜在的调节作用。因此，Sesns可能在运动防治肿瘤发生过程中起着重要作用。

此外，由于大多数肿瘤细胞在低氧微环境中通过诱导HIF-1α的表达而存活，缺氧和血液供应不足会促进肿瘤细胞侵袭性表型的形成，从而导致系统抗癌治疗失效甚至产生抵抗作用。而最近有研究发现，单次和长期有氧运动都能刺激人乳腺癌和小鼠前列腺癌原位模型中瘤体内灌注/血管形成及改善缺氧，这一结果提示运动可能通过改善肿瘤微环境抑制肿瘤的进展，并作为肿瘤治疗的敏化剂改善其对治疗的抵抗[43]。在此过程中，Sesns作为一种抗氧化酶，可能参与调节低氧状态下ROS产生而导致HIF-1α积累的水平，从而抑制肿瘤生长。

综上所述，目前对Sesns抑制肿瘤的研究提示，Sesns一方面通过p53依赖激活能量传感器 AMPK、抑制mTORC1，启动自噬发挥抗氧化应激的作用[19，20]；另一方面，在氧化应激情况下Sesns的上调能激活Nrf2途径，增强抗氧化基因的表达从而发挥抗氧化作用[29，30]；此外，由于大多数肿瘤细胞在低氧微环境中通过诱导HIF-1α的表达而存活，因此，通过调控Sesns抑制HIF-1α表达被认为是抑制肿瘤细胞进展和转移的有效策略[9]，在此调控途径中，Sesns作为一种保护线粒体和抗氧化应激的蛋白因子发挥着重要作用。有趣的是，不同类型的运动方式能够影响p53水平并启动自噬反应[40，41]；而且，运动通过改善肿瘤低氧微环境抑制肿瘤的发展，此过程与抑制HIF-1α途径相关[43]。因此，Sesns可能成为一个新的调控因子，参与运动抑制肿瘤的调节过程。

4 小结

目前，Sesns抗氧化应激作用抑制肿瘤生长的研究已取得初步进展，Sesns通过AMPK/mTOR途径诱导自噬、激活Nrf2和抑制HIF-1α三种途径，抵御ROS堆积而发挥抗氧化应激作用，从而抑制肿瘤的发生发展。尽管运动与Sesns表达调控之间的关系尚不明确，但运动通过调节代谢和改善肿瘤微环境抑制肿瘤的机制中，涉及p53、AMPK、mTORC1信号传导及HIF-1α途径的调节，提示Sesns的抗氧化作用与运动抑制肿瘤发生过程存在诸多联系。因此，深入研究和探索Sesns抗肿瘤作用的机制，将为完善运动促进健康的机制提供理论和实践依据。