环介导等温扩增微流控检测方法研究进展

殷宏 汤小玉 薛强 邹明强

（中国检验检疫科学研究院装备技术研究所 北京 100123）

1 前言

环介导等温扩增技术 （Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是2000年由日本荣研株式会社的Notomi等人提出的一种新型核酸扩增技术[1]。它依赖于4～6条特异性引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶），在等温条件（60～65℃）下可高效、快速、特异性地扩增靶序列[1-2]。该技术避免了传统核酸扩增方法对温度以及对精密仪器的依赖性，具有快速、高效、灵敏度高、特异性强、操作简单等优点，是核酸等温扩增技术的典型代表。

微全分析系统（Miniaturized Total Analysis Systems，TAS）或称芯片实验室（Laboratory-on-a-Chip，简称LOC）是跨学科的新领域，目标是通过分析化学、微机电加工（MEMS）、计算机、电子学、材料科学及生物学、医学的交叉，实现化学分析系统从试样处理到检测的整体微型化、自动化、集成化与便携化。微流控分析（Microfluidic Analysis）是微全分析系统的主要组成部分，而将化学分析的多种功能集成在邮票大小的芯片上的微流控芯片（Microfluidic chips）又是当前最活跃的发展前沿，代表着21世纪分析仪器走向微型化、集成化的发展方向[3]。具有微小可控、功能集成的微流控芯片，能够简化操作过程、加快分析速度，还可避免常规方法中样品转移所带来的损失和污染，为病原微生物等的分析提供了一个新的平台，对于发展强大的生物分子床边快速诊断（Point of care testing，POCT）具有非常重大的意义[4-5]。

基于微流控芯片的核酸扩增检测系统（Nucleic acid amplification test，NAAT）是微流控技术最有前景的应用之一，它简化了核酸扩增检测中繁琐的样品前处理和扩增产物检测步骤。在多种NAAT检测方法中，LAMP与微流控技术结合的核酸扩增检测系统则最有潜力被应用在POCT上[6]。近年来已有不少研究报道将环介导等温扩增与微流控芯片结合，用于检测病原微生物、癌症生物标志物及其他靶基因[7-12]。本文就LAMP与微流控结合的检测技术研究进展进行总结，以期为相关研究人员提供参考。

2 数字微流控环介导等温扩增技术

数字微流体（Digital microfluidics，DMF）是一种新兴的液体操作技术，使单个微液滴可以在开放阵列的电极上受到控制[13]。DMF依赖于一种能够建立电极电压的电极排列架构，它允许通过计算机的控制命令在集成系统的高精度下控制离散的微升级液滴。每一个液滴都可以被视为一个微型反应器，增强其中发生的化学和生物反应效率[14]。随着微机电系统（MEMS）的不断发展，微流控液滴技术被广泛应用于药物传输、生物工程、疾病防护、化学分析、细胞研究和功能材料合成等诸多领域[15]。由于DMF的独特优点，包括所需仪器简单、器件结构灵活以及与其他技术易于耦合等，日益成为核酸扩增POCT诊断的有力工具。

DMF装置内的核酸扩增显示了许多优势，与台式处理过程相比，可减少试剂消耗高达40000倍，提高检出限达100倍，提高反应时间50%，并且使完全的自动化流程变为可能，从而降低了成本和交叉污染[14]。整合 DMF与 LAMP技术（DMF-LAMP）可以增强反应灵敏性，而不会影响反应效率或失去反应的可靠性和功能。Coelho等设计了一种T-型DMF芯片，使用DMF-LAMP技术扩增癌基因cmyc 0.5 ng/μL 靶 DNA 只需 45 min，LAMP 反应液量只需1.54 μL，比标准台式反应极大降低了反应体积[14]。Wan等针对LAMP假阳性问题，开发了一种使用分子信标DNA探针的病原体检测DMF系统。该装置能进行低至1 μL样品的高重复性LAMP反应；在芯片上检测未知病原体可在40 min内完成；对布氏锥虫基因组DNA的检测限可达10拷贝/反应。最重要的是，在此DMF系统上使用分子信标DNA探针与LAMP反应产物中的特定序列结合，能够克服LAMP假阳性问题，区分真正特异性产物及非特异性产物[16]。

3 蝶式环介导等温扩增微流控检测技术

微流控恒温扩增碟式芯片，是通过微加工构建的微型离心式生化分析系统，可在一块芯片上同时进行数十个基因检测反应[17]。进行基因检测的离心设备，可集成控制旋转速率及其他处理步骤等的所有分析步骤。这些微流控芯片系统一般由含有微结构的圆形反应平台（通道、阀门、腔室等）组成，测量可采用标准的仪器，如比色计等昂贵的静态探测器、荧光显微镜、扫描仪或其他复杂的非整机系统[18]。

Sara Santiago-Felip等提出了一种集成在光盘上的微型反应器，用于实时靶向DNA测定。通过整合LAMP扩增和光盘技术，该研究研制出一种称为光盘LAMP（iD-LAMP）的方法。通过直接使用标准的音频–视频光盘（CD，DVD）作为生物传感平台来进行DNA扩增，并通过光盘激光驱动器扫描来读取结果，DNA扩增反应及实时监测在光盘上即可进行。该方法应用于沙门菌的致病菌检测和食品样品中牛肉的鉴定结果显示，对沙门菌和牛肉的检出限分别为5CFU/mL和10mg/g，并可在15min内进行DNA定量分析。这些结果表明，iD-LAMP方法显示了足够的灵敏度，良好的工作范围和可靠的重现性[18]。

Abkar Ahmed Sayad等开发出一种离心型微流控装置，其中试剂制备、病原体LAMP检测的主要步骤可以集成到一张简单的微流控光盘（CD）上。这个微流控CD包括用压敏胶粘层（PSA）材料结合的顶部和底部的PMMA层。应用电脑数控机器可将微流控CD的操作刻在PMMA层上。使用切刻机，在PSA层上刻绘微流控CD的其他操作，混合试剂、测量、等温扩增和检测的微流控腔室，刻在光盘的底层。LAMP实验的排气和装载孔、蜡、密封材料放在微流控CD顶层。当三层完全制备好，使用一个自定义系统将它们对准压捆在一起，最后制成一个离心型微流控病原体检测光盘。该装置对添加沙门氏菌的番茄进行检测，检出限为5×10-3ng/μL。整个过程，从样品制备到检测在微流控CD上完全自动化，在70 min 内完成[19]。

Huang等设计了一种蝶式空气绝缘微流控LAMP芯片，这种微流控芯片的基片和盖片都是直径为60 mm、厚度0.6 mm。基片上有24个测试单元和相同数量的缓冲池。测试池的直径为3 mm，深度为0.2 mm，体积为1.45 μm。将样品自动离心分至24个测试单元中，45 min内可同时测定1.45 μL反应体系中的多个临床肺炎相关病原体，且无交叉污染。这种基于微流控芯片的便携式LAMP核酸分析仪可以检测低至10拷贝数的低丰度核酸。在一项双盲实验中，特异性鉴别229例肺炎支原体、金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的临床病人痰标本，该检测系统和传统使用ABI 7500的RTPCR总符合率为99.56%。对仅占0.44%的4例不一致病例进一步进行基因测序显示该系统报告了正确的结果[20]。

周杰等采用北京博奥晶典生物技术有限公司RTisochipΤΜ-A 恒温扩增微流控芯片分析仪，基于环介导恒温扩增技术对转基因农作物样品中的PCa MV35S、T-NOS、NPTⅡ、BAR、PAT、Cry1Ac、EPSPS I、EPSPS II、FMV35S 和 GM-HRA 等转基因靶标进行同步检测。该碟式芯片共有24个样品检测孔，每孔体积为2.2 μL。在30 min以内即可得到检测结果，检出限达到0.5%；且本试剂盒所消耗 LAMP试剂量仅为普通反应的1/2～1/3，大大降低了检测成本，可广泛应用于常见转基因作物的转基因成分检测，为转基因成分筛查提供了快速、灵敏的高通量检测平台[17]。

Zhou等运用离心式聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）芯片荧光LAMP检测法，成功实现了一类弧菌的芯片LAMP快速检测，检测时间仅用30 min，芯片LAMP扩增较之常规LAMP扩增，具有操作简便，扩增速度快，便于携带，实时快速等优点，相对于常规LAMP检测法耗材量大大降低[21]。

4 卡式微流控环介导等温扩增检测技术

卡式微流控芯片，即指美国Rheonix公司（Ithaca，NY）开发的微流控CARD芯片，集成了执行全自动分析所必需的所有泵、阀门、微通道、反应和试剂储液池，以及通用DNA阵列。该CARD芯片采用注塑成型的聚苯乙烯均聚物结构，是一种可以对同一样本既提供免疫又提供核酸检测的整合微流控芯片[22-24]。每一张芯片都可以使4个单独样品同时进行样品裂解、纯化、扩增和杂交步骤。当插入到工作站，工作站的软件可控制6个平行芯片上的所有检测步骤，从而允许对24个独立样品进行同时分析。

Chen等使用CARD芯片提取人类免疫缺陷病毒（HIV）RNA大约用56 min，进行RT-LAMP检测需要20 min，分析灵敏度在每毫升103病毒颗粒（103vp/mL）范围内。此外，台式RT-LAMP和CARD芯片上的分析结果显示加入病毒与结果CT值的一致性，说明CARD芯片具有与劳动密集型的台式LAMP同样的处理能力[22]。Maite Sabalza等在Rheonix CARD芯片上采用LAMP和反向斑点杂交（RDB）技术，使用固定在DNA阵列上的核酸探针对RT-LAMP所产生的特定寨卡病毒（ZIKV）扩增子进行了杂交监测。该方法成功地利用LAMP-RDB技术检测到ZIKV RNA，并得到了一种基于杂交斑点图像密度的病毒载量半定量滴度，使用ZIKV添加唾液的检出限低至8.57×102RNA拷贝/mL （6 RNA拷贝/反应）[24]。

5 其他环介导等温扩增微流控检测技术

Song等研制了一种简单易于操作，价格低廉，使用一次性POC微流控芯片的高度敏感RT-LAMP装置用于ZIKV的快速检测。该装置包括了从样品加入至检测的所有操作单元。对芯片的热控制，使用的是无电力化学加热杯，在杯盖的抽屉里放置一包镁-铁合金作为热源，使用时通过杯盖端口将自来水注入抽屉内，与镁-铁合金发生作用产热。一次性微流控芯片可进行病毒核酸捕获、浓缩、提纯、等温扩增和检测，包含4个独立的、多功能等温扩增反应器。扩增产物的检测不需要仪器而是用无色结晶紫染料（LCV）进行目测，利用LCV在双链DNA扩增子的存在下发生颜色紫变的原理，直接用眼睛和/或用手机观察记录检测结果，在不到40 min内检测口腔样本中ZIKV的灵敏度为5个空斑形成单位（PFU）[25]。

此外，Hataoka等开发了一种LAMP反应和扩增产物超快电泳分析一体化的商品化微流控芯片，该芯片可以在15 min内完成前列腺特异性抗原基因模板检测，检测限达23 fg/μL[26]。秦奎伟等研制出一种NOA81型环介导等温扩增微流控芯片（NOA81 LAMP Microfluidic Chip，NLM-chip），并且成功地在病原微生物沙门菌的快速检测鉴定中得到运用[27]。管潇等构建了一种基于环介导等温扩增集成式微流控芯片，检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，采用荧光原位检测可得 10～105CFU的检测范围和10 CFU的检出限，该微流控 LAMP芯片结构简单，具有较高的灵敏度和特异性[28]。

6 结语

综上所述，将环介导等温扩增技术与微流控技术相结合，不论是数字微流控环介导等温扩增技术、蝶式环介导等温扩增微流控检测技术、卡式微流控环介导等温扩增检测技术还是其他环介导等温扩增微流控检测技术，均具有特异性强、敏感度高、耗样量少、耗时短、检测效率高、操作简便等诸多优点。整合环介导等温核酸扩增和微流控芯片技术，建立单重/多重、定性/定量LAMP微流控芯片模块，发展快速、灵敏、特异和适合床边检测的生物分子分析技术，将为我国食品安全、重大传染病防治、肿瘤及遗传性疾病等的快速准确诊断提供强有力的技术保障，为创新技术的发展提供良好的示范和引导。

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