虾肝肠胞虫（EHP）流行病学与检测技术研究进展

许 杰，邓 威，李 军，薛淑霞，马文婷，霍文慧

（天津市水生动物疫病预防控制中心，天津 300221）

虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）2009年首次在泰国生长缓慢的养殖斑节对虾（Penaeus monodon）中被分离而命名[1]，是一种高传染性细胞内寄生的微孢子虫，近年来在泰国、印度、越南、马来西亚、印度尼西亚和中国等主要对虾养殖国家中流行，主要感染凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）和斑节对虾等养殖虾类，可导致对虾生长极其缓慢或停滞，是影响全球对虾养殖生产的重要疾病之一[2]。

自2013年以来，我国沿海对虾养殖主产区先后发现有EHP流行，且检出率有增加趋势。2015年辽宁省营口市、盘锦市的对虾EHP检出率达34.6%[3]；粤西地区87份凡纳滨养殖对虾样品的EHP检出率为41.38%[4]；2015年浙江省舟山市大棚养殖的凡纳滨对虾普遍出现生长缓慢、养殖成功率低等现象，采集的270份病虾样本中，EHP检出率高达85.19%[5]。本文就该病的流行病学及检测技术等做一概述，以期为对虾养殖病害防控提供技术参考。

1 分类地位及特性

微孢子虫种类繁多，广泛寄生于节肢动物和鱼类体内。由孢子形成的单细胞寄生虫，其孢子呈梨形、椭圆形、茄形等，孢子长2～10 µm。微孢子虫主要寄生于对虾的肌肉和肝胰腺内，有时也寄生在心脏、胃、肠、鳃等处，感染严重时可引起病虾死亡，甚至大批死亡[6]。早期发现寄生于对虾体内的微孢子虫属于微粒子虫属（Ameson）、八孢子虫属（Agmasoma）和匹里虫属（Pleistophora）[3]。Han等[7]发现一种可感染马达加斯加、莫桑比克和沙特阿拉伯地区白对虾和斑节对虾的新微孢子虫（Perezia sp.），在对虾肌肉、肝胰腺、鳃、心脏和淋巴器官组织中有细胞质内含物和成熟孢子，受感染虾的尾部呈现不透明或白色。在对虾疾病中，微孢子虫病是由原生动物所引起的对虾病害中较为严重的一种。

EHP隶属于微孢子虫目（Microsporidia）、微孢子虫科（Nosematidae）、肠胞虫属（Enterocytozoon），是一种个体较小的微孢子虫，可在对虾细胞内形成对自身起保护作用的孢原质。EHP从早期孢子的孢原质到成熟孢子都在宿主细胞的细胞质中生长发育。多核的孢子孢原质表面有许多液泡，在早期的孢原质发育过程中发生了孢原质细胞核二分裂，在孢原质中形成了大量前孢子细胞。在孢原质表面形成早期孢子之前，孢原质在细胞质中形成电子致密盘和极管的前体。成熟孢子呈椭圆形，大小0.7 μm×1.1 μm，包含1个细胞核、5～6圈极丝、1个后液泡、1个附着在极丝上的固着盘，以及厚的高电子密度胞壁。胞壁由原生质膜、低电子密度孢子内壁（10 nm）和高电子密度孢子外壁（2 nm）组成[1]。

2 感染宿主和传播途径

对虾多通过捕食被微孢子虫寄生的其他动物而感染，所以微孢子虫常在野生对虾中发生，如褐对虾（Penaeus agtecus）和白对虾（Penaeus setiferus）等[8-9]。我国在养殖的日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）、凡纳滨对虾、罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）中也检出了EHP[10]。

EHP的传播途径有两种：一种是垂直传播，即通过亲虾传播给子代；另一种是水平传播，经口摄食寄生EHP的鲜活饵料、病虾、死虾或环境中的孢子体而感染[11]。EHP感染对虾后，先在肝胰腺细胞内形成孢原质，待孢子成熟后，再通过对虾消化道排出体外，然后散于水体并附着于藻类、碎屑、饲料表面，以及池壁和底泥环境中，成为健康对虾的潜在威胁。通过肌肉注射、口服、与EHP阳性虾同池饲养等途径，对健康虾进行EHP感染试验[12]，发现该寄生虫具有非常强的传染性，可通过多途径传播，能在虾的消化器官细胞内大量繁殖，吸收营养，从而影响肝胰腺和肠道的正常消化吸收功能，使被寄生的虾类生长发育受阻碍，严重时可导致其生长停止。

3 症状及病理变化

对虾感染EHP后不表现出明显的疾病症状，摄食正常，肠胃充满食物，不出现大批死亡，严重时肠道发炎，肝胰腺萎缩、发软，颜色变深，个别病虾可排白便。发病对虾生长速度缓慢或停滞，但个体差异大，50%～60%的对虾体重停滞在4～5 g，直至养殖周期结束[5]。天津、浙江和山东等地的研究表明：同样大小的凡纳滨对虾，EHP阳性群的平均体重比阴性群低30%；EHP阳性群中的凡纳滨对虾体长和体重变异系数分别是阴性群的（2.39±0.93）和（2.05±0.86）倍，表现为阳性群个体大小不均匀；EHP阳性群体重偏差率是阴性群的2.34～3.45倍；体长相同时，EHP阳性虾的体重波动变大[13]。2014—2015年刘珍等[10]对江苏、海南、山东等地的凡纳滨对虾进行检测发现：EHP的载量指数与对虾生长速率呈负相关；肝胰腺中的EHP载量在103copies/（ng HpDNA）数量级或EHP载量指数在3以上时，对虾生长明显变慢，代表了较高的风险水平。

剖检浙江省感染EHP凡纳滨对虾的鳃丝和肌肉组织，未见明显病理变化，但发现肝胰腺组织病变严重，肝胰腺腔体变小或消失，细胞肿大，膜结构模糊；肝胰腺上皮细胞肿大，界线模糊，细胞核坏死、消失；肝胰腺上皮细胞出现局灶性坏死或脱落；在病虾肝胰腺中可观察到EHP的孢子颗粒，大小为（1.3±0.2）μm×（0.8±0.2）μm；肝胰腺小管上皮细胞有嗜碱性的孢原质和不同发育阶段的孢子[5]。Kathy等[12]研究发现：EHP寄生在虾肠细胞内时，可引起肠壁发炎；印度尼西亚患白便综合征（White feces syndrome，WFS）的凡纳滨对虾甲壳松弛，后肠呈白色；在对虾白色粪便中检测出密集的EHP孢子和数量较少的杆状细菌；感染EHP的对虾可伴有败血性肝胰腺坏死（SHPN），中肠上皮细胞也可被EHP感染，因此EHP感染的组织类型较多。

试验表明，感染EHP病虾血淋巴中的总蛋白、白蛋白、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）和碱性磷酸酶（ALP）等反映肝胰腺功能的生物化学参数数值均比健康虾高得多[14]。肝胰腺病变致使肝胰腺功能受损。

4 EHP致病性

EHP感染往往伴随着弧菌的继发感染。EHP是对虾急性肝胰腺坏死（AHPND）和败血性肝胰腺坏死（SHPN）的一个危险因素。AHPND又称早期死亡症（EMS），其病原是一种特异的常见革兰氏阴性菌——嗜盐的副溶血性弧菌；SHPN病原为革兰氏阴性，是专性细胞内寄生的肝胰腺坏死性细菌，分散存在于感染的肝胰腺细胞质内。两者均表现为肝胰腺坏死和高死亡率。EHP感染增强了对虾AHPND、SHPN感染的敏感性，加重了肝胰腺细胞的坏死和脱落，提高了对虾急性肝胰腺坏死（AHPND）和败血性肝胰腺坏死（SHPN）的死亡率[15]。

EHP感染可导致虾免疫力降低，继而由水体中的条件致病菌引起继发感染，出现肠炎、组织坏死、红体等病症。Biju等[2]从2014年3月至2015年4月在印度坦米尔泰、安德拉邦和奥里萨邦采集生长缓慢、低死亡率的235个池塘的对虾样品进行EHP检测，发现斑节对虾和凡纳滨对虾有高发病率，并伴有细菌感染。据泰国学者报道，泰国养殖凡纳滨对虾感染EHP时，虽然表现为WFS，但WFS与EHP感染没有直接的因果关系[11]。

除EHP外，传染性皮下和造血组织坏死病毒（Infections hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV）也是导致养殖对虾生长缓慢的主要病原。世界动物卫生组织（OIE）在《水生动物卫生法典》中，将该病定为须向其申报的甲壳类疾病之一。IHHNV感染凡纳滨对虾、斑节对虾、细角滨对虾后，引起病虾生长迟缓，出现畸形，呈现出慢性感染症状，即慢性矮小残缺综合症（Runtdeformity syndrome，RDS）。病虾触角、额剑、头胸部及腹部甲壳等位置均出现不同程度病变；患病幼虾表现为额剑和触角弯曲、变形，甲壳粗糙无光泽或残缺等病变[16]。因此，应及时对养殖对虾进行检验检疫，尽快确定病原，从而进行有针对性的病害防控。

目前，白斑病毒（WSSV）对中国对虾有很强的致病力。受感染的虾常发生全身性病变，使虾体更易于遭受其他病原体的侵害。中国对虾感染WSSV后，可使仔虾的微孢子虫敏感性增加，使对虾微孢子虫感染率达90%以上[17]。如果多种养殖对虾病害并发，危害将更大，应引起养殖单位的警惕。

5 检测方法

EHP比一般的微孢子虫小，且不形成肉眼可见的胞囊；感染EHP的对虾不表现特征性临床症状。因此，需要在实验室采用组织学或分子生物学方法确诊EHP。

5.1 组织学方法

组织学方法是通过组织切片，HE染色，显微观察，揭示疾病引起的组织病理变化及器官损伤机制的方法，可诊断疾病的发生和发展过程，为病原的致病机制研究及有效防治提供理论依据。Tourtip等[1]根据微孢子虫属的超微结构特征，胞原质在细胞质中的位置，SSU rRNA序列与微孢子虫属基因组（GenBank FJ496356）比对同源性（84%），首次分离出EHP。但组织学方法检验耗时长，操作繁琐，当病原含量低或处于潜伏期时，容易漏诊或误诊，因此需结合分子生物学方法做出明确诊断。

5.2 分子生物学方法

目前，国内外已有多种分子生物学方法用于检测EHP。

5.2.1 原位杂交技术（In situ hybridization，ISH） 利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性外源核酸（即探针）与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，然后经检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来[5]。Tang等[18]采用原位杂交方法，特异性检出对虾组织、粪便和养殖水体中的EHP。雷燕等[20]根据GenBank中对虾肠道上皮细胞的EHP基因保守序列，设计合成一对特异性引物，优化PCR扩增条件，建立了EHP PCR方法。该法仅对EHP的基因组片段进行特异性PCR扩增，得到300 bp特异性扩增条带，最低可检测出约100 fg的EHP基因组DNA，可用于EHP感染初期或处于潜伏期幼虾、亲虾，以及池塘底泥、水质的检测。

5.2.2 套式PCR（nested PCR） 通过两轮PCR反应，来增强检测的特异性和敏感性。Amornrat等[11]利用套式PCR检测方法，开展了EHP诊断和分子流行病学调查。Suebsing等[20]应用环介导等温扩增（LAMP）结合荧光纳米金（AuNP）探针标记的方法检测EHP。该方法具有仪器设备要求低、结果判定简单等优点。它（0.02 fg总DNA）比传统的套式PCR（0.2 fg总DNA）更敏感，适用于现场小型实验室对亲虾、虾苗的筛选和对虾饲养期间的EHP监测。

5.2.3 TaqMan实时荧光定量PCR方法 通过对DNA模板的定量，来实现对病原的检测，对分析微孢子虫载量和开展病原防控研究具有重要意义。骆云慧等[21]发现该方法对EHP标准质粒的检测灵敏度为5.20×102copies/μL，比常规PCR高10倍；从样品核酸提取到检验完成，整个检测反应只需2 h，大大提高了EHP检测效率，可满足高通量检测。刘珍等[10]对实时荧光定量PCR反应中的引物浓度、探针浓度、退火温度和反应循环数等条件进行优化，建立了EHP的SYBR Green I实时定量PCR检测方法，检测灵敏度下限为8.3×101copies/μL。该方法灵敏度高、成本低、操作简单，适用于亲虾、苗种的快速检测。筛选简单易行、灵敏准确的EHP检测方法可为EHP早期预防控制和对虾无特定病原（SPF）种群的选育提供参考依据。

6 防控措施

在对虾养殖过程中，养殖水体、养殖工具，以及饲喂鲜活饵料等环境因素的严格把关，对控制对虾EHP感染极为重要。陈禄芝[4]在未经处理的海水样品中检测到EHP，而在经过砂滤、臭氧消毒、精密过滤、紫外消毒等一系列处理过的水体中未检测出EHP，可见消毒处理可以预防EHP感染和传播。

对虾EHP的控制需要依靠预防手段，主要包括：（1）加强苗种检疫，选择不带病原的苗种。养殖户在购苗时应主动抽样，委托具有资质的检测机构检验，采购检验合格的苗种。（2）对于曾经发生过对虾生长缓慢的养殖池塘，应采集有代表性的底泥进行检测，对于EHP阳性的底质必须进行严格的清塘灭孢。（3）车间水泥池应彻底消毒，清洗干净，晾干。（4）合理设置进排水系统。对于浮水井或外海水，需经砂滤、蓄水池沉淀、曝气、消毒等处理后方可使用；池塘排换的养殖尾水，需经无害化处理后再排放，防止病原在不同养殖池塘或养殖场间传播。

近年来，EHP的流行和传播对我国对虾养殖业的发展造成了严重影响，已成为导致对虾生长缓慢的主要病原。尽快建立病害生物防控关键技术标准，加强对虾养殖环境保护，繁育SPF对虾苗种，改进EHP检测技术，实时监控疫情，可有效保障对虾养殖的健康发展。

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