菊花的气相色谱指纹图谱及其系统聚类分析

, 丽丽

(1. 杭州职业技术学院 临江学院, 杭州 310018; 2. 浙江工业大学 化学工程学院, 杭州 310014)

菊花[1]为菊科植物菊的干燥头状花序,作为药材按产地不同,分为亳菊、滁菊、贡菊、杭菊。菊花性甘、苦,微寒,主要含有萜类、黄酮类、有机酸类、生物碱类等活性物质。现代药理研究表明,菊花具有广泛的生物活性,如抗炎、抗氧化性、抗肿瘤、保护心血管等作用[2]。

中药的疗效既不是任何单一活性成分的作用,也不是多种成分活性的简单加和,而是诸多成分间的协同作用。中药的这种非线性特征需要宏观的、非线性的、多因素的质量控制模式,指纹图谱就是适应这一特点的一种质量控制模式[3],其作用是反映具有复杂成分中药内在质量的均一性和稳定性。菊花为药食同源植物,有关菊花指纹图谱研究的报道中多采用高效液相色谱法[4]、气相色谱法[5]、光谱法[6]等,这些方法均为菊花的质量评价提供了较好的参考。但这些方法的前处理方法,如水蒸气蒸馏法、浸泡法、超声溶剂萃取法等,均存在需要样品量多、过程复杂、损失较大等问题。

固相微萃取(SPME)是20世纪90年代出现的一种无溶剂样品前处理技术,它集采集、萃取、浓缩、进样于一体,能方便地与气相色谱等联用,快速有效地分析样品中的痕量有机物,近年来被成功应用于药材的指纹图谱分析。周海梅等[7]采用顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱法(HS-SPME-GC-MS)鉴定贡黄菊、贡白菊挥发性成分。宋青坡等[8]建立了野菊花挥发油成分的气相色谱指纹图谱,为野菊花整体质量评价提供依据。系统聚类的核心思想是将各个样品各看成一类,然后规定类与类之间的距离,选择距离最小的一对合并成新的一类,计算新类与其他类之间的距离,再将距离最近的两类合并,这样每次减少一类,直至所有的样品合为一类为止。文献[9]应用系统聚类分析比较了不同产地铁皮石斛的裂解气相色谱指纹图谱。

本工作收集市售亳州、滁州、桐乡、黄山等4个产地12个菊花样品,采用HS-SPME-GC建立其指纹图谱,指认指纹图谱中的特征峰,经质谱分析比对NIST08谱库,结合相关文献对主要挥发性成分进行鉴定,采用系统聚类分析法对不同产地的12批次菊花样品的HS-SPME-GC指纹图谱进行分类比较,最后用指纹图谱对2个市售菊花产品进行产地鉴别和质量评价。

1 试验部分

1．1 仪器与试剂

Agilent 7890A/5975C型气相色谱-质谱联用仪;Agilent 7890A型气相色谱仪,配氢火焰离子检测器(FID);Supelco型手动固相微萃取装置,配65 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)/二乙烯基苯(DVB),85 μm邻苯二甲酸酐(PA),100 μm PDMS萃取头;Agilent 15 mL顶空瓶;CP 224S型分析天平;JP-500C型中药粉碎机;SPSS 16.0统计分析软件。

样品S1～S3产地为安徽亳州,样品S4～S6产地为浙江桐乡,样品S7～S9产地为安徽歙县,样品S10～S12产地为安徽滁州。从药材市场购买2个质量一般的菊花样品作为待测样品(U1和U2)。

1．2 仪器工作条件

1) 气相色谱条件 RESTEK Rtx-1701石英毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);进样口温度250 ℃;不分流模式;载气为氦气,流量1 mL·min-1;FID温度300 ℃。柱升温程序:初始温度35 ℃,保持2 min;以5 ℃·min-1速率升温至200 ℃,保持15 min。

2) 质谱条件 电子轰击(EI)离子源,电离能量70 eV,温度230 ℃;扫描范围m/z50～550;传输线温度280 ℃。

1．3 试验方法

取干燥菊花样品10 g,用中药粉碎机研磨成粉,过0.125 mm筛,装瓶,备用。

HS-SPME操作过程:称取粉碎后样品0.50 g,装入20 mL螺口顶空样品瓶中,用聚四氟乙烯隔垫密封,于80 ℃水浴恒温预热30 min,将固相微萃取器的萃取头通过聚四氟乙烯隔垫插入样品瓶中,顶空吸附30 min,在气相色谱进样口250 ℃下解吸5 min后,经气相色谱和质谱进行分析。

1．4 菊花的HS-SPME-GC指纹图谱的建立

参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》,分别取12个菊花样品S1～S12、2个市售菊花样品U1～U2,按试验方法进行分析,记录色谱图。12个样品及2个市售菊花样品的22个共有峰相对于参照峰的面积比得到14×22阶原始数据矩阵(见表2中的S1～S12峰面积比值部分,U1～U2计算方法同表2),采用SPSS 16.0软件包中的聚类分析程序对此矩阵进行聚类分析。

2 结果与讨论

2．1 HS-SPME-GC试验条件的选择

萃取温度、萃取时间、萃取头的选择对试验结果十分重要。萃取温度过高、萃取时间过长,会缩短萃取头的使用寿命,浪费能源、耗材;相反,萃取温度过低、萃取时间过短,萃取物质少,峰的强度低;而在适当的温度、时间区间内,峰的数量和强度均适宜。试验考察了萃取温度与峰面积的关系,结果表明:总峰面积随着萃取温度的升高而显著增大,80 ℃时到达最大值,90 ℃趋于平缓。因此,试验选择80 ℃作为萃取温度。试验考察了萃取时间与峰面积的关系,结果表明:总峰面积随着萃取时间的增加而迅速增大,顶空时间30 min时到达最大值,说明30 min时SPME的吸附已经达到平衡。因此,试验选择萃取时间为30 min。

试验考察了65 μm PDMS/DVB、85 μm PA、100 μm PDMS等3种萃取头的萃取效果,结果表明:采用65 μm PDMS/DVB萃取头能检出48种化合物,而采用85 μm PA萃取头能检出41种化合物,采用100 μm PDMS萃取头能检出45种化合物;采用65 μm PDMS/DVB萃取头时,色谱分析响应值最高。因此,试验选择65 μm PDMS/DVB萃取头。

2．2 菊花HS-SPME-GC指纹图谱的建立

2．2．1 菊花HS-SPME-GC指纹图谱参照峰与共有峰的选择

按试验方法测定12个菊花样品,图1为S5样品的色谱图。

图1 S5菊花样品HS-SPME-GC图谱Fig. 1 HS-SPME-GC chromatogram of sample S5

由图1可知:菊花顶空固相微萃取产生近50个色谱峰,选择共有峰作为考察对象,即保留时间为35 min内的1～22号峰。12个样品的共有峰面积分别占总峰面积的80%以上。选择保留时间为25.57 min的9号峰为参照峰,此峰为有效成分色谱峰、相对强度较强且较稳定。

2．2．2 菊花HS-SPME-GC指纹图谱的建立

根据12个菊花样品的色谱图计算22个共有峰的相对保留时间α(各组分的调整保留时间与峰9的调整保留时间的比)和峰面积百分比S(该组分峰面积占共有峰面积之和的百分比),以及各样品与S5的S值的最大差值[ΔS(Max)],结果见表1。

表1 12个菊花样品的HS-SPME-GC指纹图谱数据Tab. 1 Data of HS-SPME-GC fingerprints of 12 chrysanthemum samples

表1(续)

依据指纹图谱的技术要求,由表1可知:当α为0.906,1.000,1.103,1.172时,10%

2．2．3 菊花化学成分MS分析

结合文献[11-14]以及质谱分析可知,菊花化学成分大部分为倍半萜烯烃及其氧化衍生物。表1中峰3为樟脑,峰4为龙脑,峰9为菊酮,峰1,5～8和峰10～12为倍半萜烯烃,分别为α-蒎烯、β-榄香烯、丁香烯、石竹烯、α-姜黄烯、β-石竹烯、β-金合欢烯和β-红没药烯;峰18～22为倍半萜的氧化衍生物,分别为桉叶醇、雪松醇、桉叶烯醇、杜松醇、红没药醇。

2．3 菊花样品的系统聚类分析

对14(12个样品及2个市售菊花样品)×22(22个共有峰的相对峰面积)阶原始数据矩阵,采用SPSS 16.0软件包中的聚类分析程序对此矩阵进行聚类分组。在方法上对数据变量作均数为1的转换,使其标准化,采用欧氏距离作为间隔尺度变量,每两样本以类间平均连接法连接,可输出系统聚类分析图。

图2为样品的系统聚类分析图,横坐标为临界值,即类间的距离,纵坐标为样品名。临界值越小,表示谱图越相似。

图2 菊花样品的系统聚类分析图Fig. 2 Hierarchical cluster analysis diagram of chrysanthemum samples

由图2可知:当临界值介于1至15时,来源于4个产地的样品S1～S3,样品S4～S6,样品S7～S9和样品S10～S12分为4类,反映了这4类菊花的不同产地来源。当临界值为16时,源于安徽歙县(经度118°44′,纬度29°88′)的样品S7～S9和安徽亳州(经度115°47′,纬度33°52′)的样品S1～S3聚为一类。当临界值介于16至20时,源于安徽滁州(经度118°31′,纬度32°33′)的样品S10～S12与浙江桐乡(经度120°32′,纬度30°38′)的样品S4～S6从两类聚为一类。当临界值为25时,4个产地的菊花聚为一类,表明了地域的差别。另外,2个市售菊花样品U1和U2,经相同聚类分析方法,可以判定样品U1产地为浙江桐乡,样品U2产地为安徽滁州。由样品U1与样品S4～S6有一点距离,说明市售菊花样品质量稍差,经专家鉴定为一级杭白菊。结果表明,系统聚类分析法既能比较全面、综合地反映不同产地菊花HS-SPME-GC图谱之间的差异,也能表明相邻地域之间的菊花样品之间的相似,还能对市售菊花产品进行产地鉴别和质量评价。

本工作采用HS-SPME-GC建立4个产地12个菊花样品和2个市售菊花样品的气相色谱指纹图谱,并进行系统聚类分析。结果表明,所建立的方法既能反映菊花HS-SPME-GC谱图之间的相似关系又能反映不同产地之间的差异,可对市售菊花产品进行产地鉴别和质量评价。

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