环状RNA-circ-VCAN在胶质瘤细胞中功能及作用机制研究

黄佐於 谢琳 欧阳乐平 何明亮 刘家豪 刘安民

神经胶质瘤是目前最致命和最常见的原发性神经系统肿瘤［1，2］，具有异质性遗传因子畸变的特征［3，4］。即使采用先进的手术，化疗和放疗，胶质瘤患者的中位生存率仍然很低［5，6］。为了改善神经胶质瘤的治疗，需要进一步探索胶质瘤恶性进展的分子机制。环状RNA（circ-RNA）是一类新的RNA，是一种不具有5‘至3’极性的共价闭环结构，不含有多聚腺苷酸化的尾部［7，8］。较多的研究证实，哺乳动物的circ-RNA表达保守，在不同的生理和病理过程中起着重要作用，特别是在一些特殊细胞类型或发育阶段中［7］，例如circMTO1是以序列特异性方式靶向miR-9，以抑制肝细胞癌恶性进展过程［8］。此外，具有miR-29a结合位点的环状RNA MYLK调节miR-29a的表达，促进膀胱癌发生发展［9］。因此，弄清circ-RNA在肿瘤中的分子机制有助于推进肿瘤治疗方法的改进。

已有文献报道利用生物信息学分析出环状RNA VCAN（circular RNA VCAN，circ-VCAN）在少突胶质细胞瘤和胶质母细胞瘤中均高度表达［10］。在这项研究中，我们的实验发现hsa_circ_0073237（circ-VCAN）在胶质瘤细胞系中上调。此外，敲低circ-VCAN后可以有效抑制胶质瘤细胞的增殖。进一步的实验表明敲除circ-VCAN后也检测到PP65的表达减少，我们推测，circ-VCAN可能与NF-κB信号通路相关，提示circ-VCAN可能成为胶质瘤新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

胶质瘤细胞株U373和T98G购自ATCC细胞库，并于中山大学孙逸仙纪念医院医研中心保种。胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶购自Gibco公司，聚合酶链反应（PCR）试剂盒购自TaKaRa公司。鼠抗一抗P-P65抗体购自Abcam公司，PCR引物由上海生工生物有限公司构建。

1.2 细胞培养

U373和T98G细胞系的培养液成份为10%胎牛血清和DMEM培养基，培养液含青霉素/链霉素100 U/mL。细胞培养37℃、含5%CO2培养箱中，0.25%的胰酶常规消化，选择生长较好的对数期进行实验。

1.3 核质分离实验及RNaseR消化线性RNA实验

将U373和T98G细胞分别以2×105个/孔铺入6孔板各3个孔，当细胞处于80%融合度时用0.25%的胰酶消化细胞，1000 g离心2 min，根据核质分离试剂盒步骤，分别回收胞质和胞核RNA，Nano 2000测定含量，储存待用。将RNA分为RNase消化组和非消化组两组，准备10×Reaction Buffer配制10μL总反应体系，用于消化线性RNA，每1μg RNA用1 U（1个单位）的RNase消化，37℃10 min。随后用苯酚/氯仿、乙醇沉淀法提取消化产物逆转录为cDNA，通过实时荧光定量PCR法检测circ-VCAN在核质中的表达，实验共重复三次。

1.4 实时荧光定量PCR检测RNA表达水平

抽提样品RNA，经浓度和纯度测定后，逆转录合成cDNA样品，以GAPDH为内参。将SYBR Green预混液、模板、上/下游引物、ddH2O配制成PCR反应溶液，置于Real-time PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：95℃2 min预变性，然后按 95℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，共 40 个循环，最后72℃7 min延伸。结果通过2-△△CT法分析基因相对表达量。

1.5 细胞转染及CCK-8检测细胞增殖实验

从Invitrogen设计和购买靶向circ-VCAN的siRNA片段。并设计circ-VCAN的阴性对照序列片段。将胶质瘤细胞以每孔2×105个细胞接种在6孔板中。根据方案说明书，使用Lipofectamine 2000将siRNA和siRNA-NC转染到胶质瘤细胞中。转染24小时后收集细胞用于后续的实验。U373和T98G细胞增殖检测实验主要通过CCK-8试剂盒完成。实验分为对照组和处理组，采用96孔板中，每个孔铺大约1×103个细胞，培养5 d。加入CCK-8后，37℃孵育2 h，检测OD450的值。

1.6 Western blot检测蛋白表达水平

在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的蛋白上样缓冲液，100℃沸水浴加热3～5 min，以充分变性蛋白。经过跑胶、转膜、封闭、一抗、二抗及显影液孵育后，于Bio-Rad公司化学发光成像仪显影成像。

1.7 统计学方法

数据通过Graphad Prism软件作图和统计，以均数±标准差表示。实验均采用两独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鉴定circ-VCAN在胶质瘤细胞系中的表达

首先分别以细胞U373的基因组DNA（gDNA）和cDNA作为模板，通过PCR技术扩增circ-VCAN包含成环位点（back spliced junction）的片段，结果表明模板为cDNA组的PCR产物出现约200 bp的目的条带，并且基因组DNA不能特异性扩增circ-VCAN（图1A）。Sanger测序结果验证了成环位点序列（图1B）。利用R NaseR消化细胞U373的RNA，qRT-PCR结果显示RNaseR处理前后，circ-VCAN表达水平无明显变化，但是线性mVCAN表达水平却显著降低（图1A，图1C，P＜0.01）。

图1 Circ-VCAN在胶质瘤细胞系中的鉴定

2.2 circ-VCAN在胶质瘤细胞中高表达且主要存在细胞质中

circ-VCAN在U373和T98G中高表达，在HA1800中低表达（图2A）进一步通过细胞核质分离实验证明circ-VCAN主要存在细胞质中（图2B）。

2.3 沉默circ-VCAN抑制胶质瘤细胞系的增殖

我们订购了2条siRNA干扰circ-VCAN的表达，其中si-circVCAN-1有明显的干扰抑制效果（图3A）。干扰circ-VCAN实验组CCK8的OD450显著低于对照组（图3B，P＜0.01）。

2.4 环状RNA-circ-VCAN作用可能与NF-κB信号通路有关

在U373和T98G细胞中转入si-circ-VCAN后，P-P65的表达水平降低（图4A，P＜0.05）。

图2 circ-VCAN在胶质瘤细胞中高表达且主要存在于细胞质中

图3 沉默circ-VCAN抑制胶质瘤细胞系的增殖

图4 环状RNA-circ-VCAN作用可能与NF-κB信号通路有关

3 讨论

越来越多的研究显示circ-RNA在疾病的发生与发展中起着重要的作用。已有文献报道circ-RNA参与胶质瘤恶性进展［11］。Circ-TTBK2在胶质瘤组织和细胞系中过度表达，其作为miR-217海绵以序列特异性方式介导神经胶质瘤恶性进展［12］。此外，cZNF292是重要的环状致癌RNA，其影响胶质瘤细胞增殖和细胞周期进程［13］。

据文献报道，circ-VCAN亲本基因能够在脑组织中表达，VCAN基因已被实验证实为胶质瘤的致病基因［14］。因此，神经胶质瘤中高度表达的VCAN衍生的circ-RNA也被认为与胶质瘤发生有关，体外研究已发现circ-VCAN在少突胶质细胞瘤和胶质母细胞瘤中均高度表达［10］。在本文中，我们主要报道了针对circ-VCAN在U373和T98G中的功能与初步的机制研究结果。研究结果证实了相对于正常胶质细胞（HA1800），胶质瘤细胞中确实高表达circ-VCAN。作为在细胞质表达量较多的circ-RNA，circ-VCAN能抵抗RNaseR的消化，而且敲低circ-VCAN的表达可以减慢胶质瘤细胞的增殖。此外，我们的研究进一步发现，在胶质瘤细胞系中，circ-VCAN在细胞的功能可能与NF-κB信号通路有关。目前大量的研究表明circ-VCAN可以与多种miRNA结合起到miRNA“海绵体”的作用，我们猜测在胶质瘤细胞系circ-VCAN是否可能通过吸附一些miRNA从而影响PP65的表达，从而影响NF-κB信号通路。已有文献报道，P-P65是一种重要的细胞生长和分化的调控因子，但是关于P-P65与circ-VACN的关系，及其随后机制探讨。

本文在实验上并未做深入探讨，这也是本文的不足之处。此外，本研究并未进一步证实circ-VCAN的调控关系是否能在活体体内实验上重复，这一点也是今后研究的重要内容。综上的结果，本研究表明circ-VCAN能够促进胶质瘤细胞的增殖，circ-VCAN可能通过调控P-P65表达是促进胶质瘤细胞的增殖的机制。在后续的研究中，深入地探讨机制可能有利于治疗胶质瘤提供新的思路。

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